第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建•Ti质粒的发现历史•1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumorinducingplasmid）,简称Ti质粒.•最初的发现和命名是1907年,Smith和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)诱发形成的.Ti质粒的遗传特性及类型Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒结构特性均有差别。根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。Ti质粒的基因位点及其功能区域•Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regionsencodingconjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。LBRBTi质粒介导基因转化的原理•1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。•2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIRA蛋白传递给VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。•3.T-DNA单链分子释放：virD基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。•4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。Ti质粒介导基因转化的原理•5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子,在RB序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。•6.T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。信号受体（VIRA）酚类物质诱导信号VIRGRBLB转移到寄主细胞整合到植物染色体中T-DNA单链分子释放VIRG激活virB、virC、virD、virE、virH表达VIRD植物伤口诱导信号信号传递诱导表达VIRD2、VIRD4、VIRB、VIRE2等土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制酚类物质VIRA由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。一、Ti质粒的改造(一)Ti质粒1.定义是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA大分子，其大小为180-240kb。2.种类2.1根据冠瘿碱的种类不同章鱼碱型(octopine);胭脂碱型(nopaline);农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)or琥珀碱型(succinamopine)第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建(一)Ti质粒2.种类2.2根据功能区段不同基因转移T-DNA区(transferredDNAregion)：与基因转移相关毒性区,即Vir区(Virulenceregion,Vir):激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区接合转移区(regionencodingconjuation,Con)调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移自我复制...
