实验二、血涂片制备与染色实验内容•一、原理•二、器材•三、试剂与标本•四、操作•五、注意事项课堂目标1.学会制备一张良好的血涂片2.能染色一张良好的血涂片3.通过实验掌握血涂片制备的影响因素、瑞氏染色的原理及注意事项实验难点实验重点实验重点一、原理瑞氏染液是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料溶于甲醇而成，细胞的受色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此，染色后，在同一张血片上，可以看到各种不同的色彩。例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；嗜碱性颗粒和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝结合，染蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为中性物质。二、器材三、试剂与标本1．载玻片2．推片3．显微镜4.染色架1.瑞氏染液：瑞氏染料、甲醇2.磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）磷酸二氢钾（KH2PO4）磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.EDTA－K2抗凝静脉血四、操作1.制备血涂片（1）取血滴：取血液一滴置于载玻片的一端。（2）散开血滴：左手平执载玻片，右手持推片在血滴前沿，后拉接触血滴，使血液沿推片边缘散开。（3）推片：将推片与载玻片呈30～35°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片。（4）干燥涂片：空气干燥血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。血涂片制备示意图血膜分布不均匀的原因血膜分布不均匀的原因四、操作2．瑞氏染色（1）标记涂片：在载玻片的一端用记号笔编号，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢，然后将玻片平置于染色架上。（2）加染液：滴加染液数滴，使其迅速盖满血涂片，固定约0.5～1min。（3）加缓冲液：滴加等量或稍多的缓冲液，轻轻摇动玻片或用吸球将染液充分混合。染色5～10min。（4）冲洗：用接近中性的流水冲去染液，待干后镜检。3．观察结果：在低倍镜下观察血涂片制作与染色，在油镜下观察细胞的染色与形态。五、注意事项1.玻片必须清洁、干燥、无尘。①使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。②新玻片：应用1mol/LHCL浸泡24小时，用清水彻底冲洗，烘干备用。③用过的玻片：应在清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。④边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。2．血涂片质量不佳的影响因素:血滴大小、角度大小、推片速度、血细胞比容、载玻片的清洁、推片的宽度等。五、注意事项3．染色时注意事项（1）干燥涂片：血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。（2）染色时间的长短：与染液浓度、室温高低及有核细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握最佳染色时间和加缓冲液的比例。（3）染液不能过少，以防蒸发沉淀。（4）冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗。（5）染色过深脱色时，加甲醇；染色过浅时复染。（6）染色偏酸或偏碱时，应更换缓冲液再染。（7）瑞氏染液新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。【小结】推片：载玻片→取血滴→散开血滴→推片→干燥染色：0.5－1min5－10min加染液加缓冲液流水冲洗干后镜检实验六白细胞形态观察【目的】掌握外周血中五种白细胞正常形态。【原理】用普通光学显微镜，直接观察经瑞氏染色后血涂片上的白细胞。从细胞大小、细胞核、细胞质等多方面观察细胞。【器材】1.显微镜2.香柏油、擦镜纸、乙醚【标本】制备染色良好的血涂片。1.制作血片并染色，干燥后待用2.低倍镜观察白细胞的数量、分布和染色情况3.选择血涂片体尾交界处染色良好的部位，用油镜观察各种白细胞的形态4.用彩笔绘制五种白细胞并...
