噬菌体展示技术解析VIP专享VIP免费

噬菌体展示技术解析噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲和力抗体库由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术（phagedisplay）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白下图粗略展示了技术筛选的过程：二、噬菌体展示系统的分类1.M13噬菌体展示系统M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ和PⅧ展示系统。pⅢ蛋白分子量为42kDa，分布在噬菌体颗粒的一端。一般一个噬菌体有3-5个拷贝的pⅢ蛋白，可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。pⅢ系统的主要优点是对展示的外源蛋白大小无严格的要求，该系统可以用来展示分子量较大的蛋白。PⅧ蛋白的分子量为5.2kDa，主要分布在噬菌体颗粒的两侧。由于该蛋白的分子量很小，只适合用来展示外源短肽。外源肽段的太大会影响病毒包装，不能形成有功能的噬菌体。但由于pⅢ蛋白拷贝数较多，该系统比较适合用来筛选低亲和力的配体。2.λ噬菌体展示系统λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体，有直径55nm的二十面体头部，末端有细长尾丝。基因组为48.5kb的线性双链DNA分子，有黏性末端即单链延伸12个核苷酸，感染后线性基因组可立即环化。噬菌体的头部由D蛋白和V蛋白构成，可以构建D蛋白和V蛋白的展示系统。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白质(100kDa以上蛋白质)及宿主细胞有毒性的蛋白质，适用范围极广。3.T4噬菌体展示系统T4噬菌体基因组DNA为双链线形，呈环状排列，噬菌体衣壳的有两种非必需外壳蛋白：SOC(smalloutercapsidprotein)和HOC(highlyantigenicoutercapsidprotein)。T4噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体表面。T4噬菌体的主要优点是可以实现SOC位点和HOC位点同时展示，展示的拷贝数也较多。4.T7噬菌体展示系统T7噬菌体基因组为线性双链DNA，其衣壳蛋白通常有两种形式，即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基)，10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用来构建噬菌体展示系统。T7噬菌体展示系统可以高拷贝展示50个氨基酸的多肽，以低拷贝量(0.1-1/噬菌体)或以中拷贝量(5-15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质。因此，广泛应用于筛选不同分子量，不同亲和力的蛋白质。三、噬菌体展示技术的应用1.抗体筛选将抗体可变区的基因插入噬菌体基因组中，表达的抗体展示到噬菌体的表面，构建噬菌体展示抗体库，可以在体外模拟抗体生成的过程，筛选针对任何抗原的抗体。相对于杂交瘤技术，通过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体，可以不经过免疫，缩短抗体生产的周期也可以筛选在体内免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗体，适用范围广。噬菌体...