流式细胞基本知识

1、流式细胞仪上的 FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？ FL2-W 是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H 是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。 2、流式同型对照怎样选择？ 同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用 an normal serum（与一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody ）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的 mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的 isotype 是 mouse IgG2a，所以可以用 purified（纯化的） mouse IgG2a 来做 OX-42 的同型对照（Isotype Control）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。 同型对照：是指与 MoAb 相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如 IgG1 FITC、IgG2ａ、PE 等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC 受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与 MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P 比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与 MoAb 不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。 3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下： （1）钙荧光探针负载； （2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为 F 值。 （3）加入 10%Triton X 100，（破膜用）；加入 1 mmol/L 氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育 1~10min，测定荧光即 Fmax 值。 （4）加入 EGTA，20μl（钙螯合剂），孵育 1~10min，激发波长 488nm 测定荧光，即 Fmin 值。 这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。 因为正常血浆中 Ca2＋浓度是 1mM，细胞外液的 Ca2＋...