DNA提取和制备解读VIP免费

第一部分第一部分DNADNA提提取总论取总论一、提取一、提取DNADNA总的原则：总的原则：11保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；22其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；33核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；44其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，，也应尽量去除。也应尽量去除。二、样本来源：二、样本来源：理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取DNADNA样本选择取决于样本选择取决于试验目的试验目的全血是基因组提取最常见的样本全血是基因组提取最常见的样本血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中料，其中全血、血浆（血清）标本占分子全血、血浆（血清）标本占分子诊断的诊断的60%60%以上以上DNADNA提取前样本采集、预处理和保存：提取前样本采集、预处理和保存：（一）全血（一）全血1.1.抗凝剂抗凝剂EDTA-Na2EDTA-Na2或枸橼酸钠或枸橼酸钠作为抗凝剂作为抗凝剂不宜使用肝素不宜使用肝素抗凝剂处理血抗凝剂处理血肝素肝素柠檬酸柠檬酸**EDTA*EDTA*-80-80℃℃保存保存22个月，第个月，第1010天收率天收率90%90%44℃℃第四天收率第四天收率90%90%第第1010天提取天提取效果差效果差第十天收率第十天收率85%85%室温室温提取效果差提取效果差第四天收率第四天收率90%90%第十天提取效果差第十天提取效果差（二）血浆和血清（二）血浆和血清血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测测..三、三、DNADNA的收率的收率样本类型样本类型基因组基因组DNADNA收率收率2020mgmg肝脏组织肝脏组织88gg100100mgmg豆苗豆苗1010gg100100ll全血全血22gg22101066培养细胞培养细胞1010gg四、四、DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤11、、核酸的释放：核酸的释放：破裂细胞释放核酸（机械法与非机械法）破裂细胞释放核酸（机械法与非机械法）22、核酸的分离与纯化、核酸的分离与纯化33、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤44、、DNADNA鉴定：浓度鉴定鉴定：浓度鉴定纯度鉴定纯度鉴定完整性鉴定完整性鉴定五、五、DNADNA提取试验中常遇到的问题提取试验中常遇到的问题基因组基因组DNADNA收率较低或无基因组收率较低或无基因组DNADNA样本材料太少样本材料太少细胞破裂不够充分，细胞破裂不够充分，DNADNA释放不完释放不完全全离心力偏小离心力偏小两相分离不完全……两相分离不完全……DNADNA降解的原因降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量样本本身存在大量DNADNA酶酶提取提取DNADNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？提取的基因组提取的基因组DNADNA盐浓度过高盐浓度过高基因组基因组DNADNA中乙醇未清除净中乙醇未清除净基因组基因组DNADNA中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素提取基因组提取基因组DNADNA，，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护加入多糖，保护DNADNA长度长度不可忽视的细节—血液基因组提取天根生化科技（北京）有限公司没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:构建文库PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取原则1：DNA片段长度•没有严格要求常规PCR•严格要求产物纯度存档、产物长期保存Southern杂交荧光...