第五节第五节DNADNA的提取的提取一、一、DNADNA的提取的提取1、材料：动物、植物、微生物2、试剂：组织匀浆液：NaCL,Tris-HCL,EDTA,低温离心：4℃，5000rpm,1min裂解液：NaCL,Tris-HCL,EDTA，蛋白酶K,55,℃过夜RNase:37,1h℃等体积酚/氯仿抽提，10000rpm，10min,4(℃重复)DNA水相，例外情况沉淀（-20℃，1-2h）、洗涤，离心，干燥TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。注意事项植物材料：样品处理，液氮2、试剂：细胞提取液：NaCL,Tris-HCL,EDTA,SDS，KCL，β-巯基乙醇，65℃水浴，20min离心：4℃，5000rpm,10minRNase:37,30min℃等体积酚/氯仿抽提，10000rpm，10min,4(℃重复)沉淀（-20℃，1-2h）、洗涤，离心，干燥TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。注意第六节第六节DNADNA序列测定序列测定一、一、DNADNA序列测定序列测定即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。1963年，SangerSanger和ThompsonThompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，SangerSanger和Maxam----GilbertMaxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。二、二、DNADNA序列测定工作原理序列测定工作原理在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。三、核酸序列分析的目的意义和策略三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（具体方法）（一）序列分析的目的，（一）序列分析的目的，22种：种：11、确证性测序、确证性测序通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时比较野生型基因上同源区和测定的突变体的相应序列的差异。（已知基因序列）22、从头序列、从头序列目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列）（二）测定在生物、医学领域相应应用，（二）测定在生物、医学领域相应应用，22个方面：个方面：11、、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。22、、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。四、测序的常用方法四、测序的常用方法DNA序列测定常用方法有如下3种：1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速。不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：11、制备待测、制备待测DNADNA序列模板；序列模板；22、酶促或化学反应将其转变“等差数列”、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（（n=1n=1））33、、PAGEPAGE44、读序、读序五、测序的基本过程五、测序的基本过程六、测序技术的最近发展六、测序技术的最近发展11、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性。22、自动化测序仪、自动化测序仪以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础，微机处理。33、热循环测序、热循环测序使极少数测序产物线性放大。44、测序商品化、测序商品化60.-180.￥，搞定。七、七、DNADNA序列测定的应用序列测定的应用分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列分析基因序列...
