PCR技术在新冠病毒核酸检测中的运用检验科卢国润2020.9.23一、什么是PCR二、PCR实验室三、新冠病毒核酸检测一、什么是PCRPCR•PCR技术是由Cetus公司kearyBMullist和加利福尼亚大学Henery、Erlich于1985年联合创造的。发明人1993年获诺贝化学奖。•PCR:聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。•优点：敏感性高、特异性强、快速、简便。PCR原理：是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，所以PCR可以使DNA的合成呈指数增长。二、PCR实验室PCR实验室•实验室设置相关标准•医学生物安全二级实验室---几个重要概念PCR实验室•实验室设置相关标准•GB/T20469-2006《临床实验室设计总则》--黄文芳主任•WS/T442-2014《临床实验室生物安全指南》--尚红主任•CNAS-CL05-2015《实验室生物安全认可准则》--认可委的标准•WS233—2017代替WS233—2002《病原微生物实验室生物安全通用准则》---国家卫生行业标准•T-CECS662-2020《医学生物安全二级实验室建筑技术标准》--中国工程建设标准化协会标准（有多位检验专家参与了编写）PCR实验室•医学生物安全二级实验室---几个重要概念•（1）临床实验室都应设置：生物安全二级实验室（普通型BSL-2和加强型BSL-2+）•（2）加强型生物安全二级实验室（enhancedbiosafetylevel2laboratory）•在普通型生物安全二级实验室的基础上，通过机械通风系统（新风系统）---形成负压、压力差和气流走向（分子生物学实验室）。PCR实验室•（3）实验室辅助工作区（non—contaminationzone）是指生物风险相对较小的区域，也指生物安全实验室中防护区以外的区域。（是否是指清洁区）•（4）实验室防护区（laboratorycontainmentarea）实验室的物理分区，该区域内生物风险相对较大，需对实验室的平面设计、围护结构的密闭性、气流，以及人员进入、个体防护等进行控制的区域。（没有清洁区、半污区和污染区的说法）•（5）核心工作间（corearea）是生物安全实验室中开展实验室活动的主要区域，通常是指生物安全柜或动物饲养和操作间所在的房间。PCR实验室三、新冠病毒核酸检测新冠病毒核酸检测新冠病毒的生物学特性相关指南和标准标本采集、运送防护和处理个人的防护等级人员和实验室要求核酸检测新冠病毒的生物学特性1、冠状病毒：单股正链RNA病毒；α、β、γ和δ四个属。2、致病冠状病毒：α属的229E、NL63，β属的OC43、HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和2019-nCoV（SARS-CoV-2）。3、基因组通常编码四种结构蛋白：刺突（spike，S），包膜（membrane，M），被膜（envelope，E），核衣壳（nucleocapsid，N）以及一些非结构蛋白及独特的配件蛋白。新冠病毒的生物学特性4、新冠状病毒（2019-nCoV、SARS-CoV-2）（1）基因组Sanger测序：发现5位患者BALF基因组序列相似度达99.9%。基因组全长29,870bp，GC含量37.99%-38.02%。基因组结构5-ORF1ab-S-E-M-N-3，与SARS-CoV相似且具Sarbecovirus亚属特征的ORF3，ORF6，ORF7，ORF8基因。（2）基因组全长同源性比对：其与SARS-CoVTor2相似度79.0%，与MERS-CoV相似度51.8%。与分离自中华菊头蝠的蝙蝠冠状病毒SL-CoVZC45和ZXC21有87.6%和87.7%的相似度。然而，冠状病毒高度保守的RdRp序列与SL-CoVZC45相比，只有86.3%-86.5%的相似度，故认为新发现的冠状病毒种应该为Betacoronavirus属，Sarbecovirus亚属下的一种新型冠状病毒。新冠病毒的生物学特性新冠病毒的生物学特性•（3）传染性：•1）ACE2（血管紧张素转换酶2）：S-蛋白与ACE2结合进入细胞。ACE2是新冠病毒•初次感染的限制因子。••2）鼻腔里面的杯状细胞和纤毛细胞的ACE2表达水平最高。同理鼻拭子的病毒载量•显著高于咽拭子••3）S-蛋白和ACE2受体结合：SARS-CoV-2平衡解离常数Kd是15nM•SARS-CoVKd是325.8nM。•亲和力相差10-20倍••4）在出现症状的头5天里，新冠病毒可在鼻咽部活跃复制。•在出现症状的5天内，RNA水平就达到了峰值，较SARS病毒高出...
