RealtimePCR技术介绍VIP免费

基因的结构基因和基因组基因：是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和。基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X109(30亿bp)，共编码约10万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-ValueParadox)。真核生物基因组真核生物基因组的特点：①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中。②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2~3％)。基因诊断•基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。•基因诊断的主要技术：1、核酸分子杂交2、聚合酶链反应（PCR）3、基因芯片技术Real-timeqPCR和常规PCR的区别•实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测•敏感性高•需要样品少•特异性高•精确定量Real-timePCR概述实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术在常规PCR基础上运用荧光能量传递(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。聚合酶链反应（PCR）技术PCR的基本过程PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包括下列三个基本步骤：1、变性（Denaturation）：待扩增的DNA模板加热变性成单链；2、退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；3、延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。(c)(c)(b)(b)引物引物225’5’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’(d)(d)新引新引物物5’5’3’3’靶靶DNADNA的扩增的扩增(a)(a)5’5’3’3’引物引物113’3’5’5’3’3’5’5’引物引物22互补链互补链引物引物11互补链互补链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链55’’33’’3’3’5’5’引物引物11互补链互补链引物引物22互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)Real-timePCR优点•特异性更强；•有效解决PCR污染问题（全封闭反应），自动化程度高；•灵敏度高；•重复性好，结果稳定可靠，同一标本的Ct值相同。Ct值(cyclethreshold)Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10•SDcycle3-15。同一模板在96孔PCR仪上做的96次重复实验Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光化学•荧光染料法：非饱和染料SYBRGreenI法饱和染料LCGreen法•荧光探针法：寡核苷酸探针：TaqMan探针法TaqMan-MGB探针法杂技探针：Molecularbeacons（分子信标）FRET（双杂交探针）SYBRGreen染料法DNATargetSequenceDenaturationPolymerizationCompletePolymerizationSYBRGreen染料法定量的特点•方法简便，不需要设计探针；•成本低；•...