RedET同源重组技术概述VIP免费

Red/ET同源重组技术2015年3月25日内容一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用遗传重组•基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。•染色体的遗传差异主要由两种机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。◘重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流◘遗传重组与重组DNA技术异常广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程一、什么是Red/ET同源重组1.概念Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E.coli中λ噬菌体的重组酶Redα/Redβ或者是来自Rac噬菌体的重组酶RecE/RecT进行基因同源重组的DNA工程技术。2.原理首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single-strandannealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒3.特点：Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。4.应用这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。gbalphageETRacphageRacrecE/recT操纵子=λred操纵子,操纵子中的重组酶（Redα/Redβ或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；recE=redα：5’→3’dsDNA核酸外切酶；recT=redβ：ssDNA结合和退火蛋白；redγ：防止E.coli中的核酸酶RecBCD对外源线性DNA片段的消化。λ噬菌体的pL操纵子示意图Reda(RecE)Red同源重组原理示意图Single-strandannealingStrandinvasion3’5’DigestionBinding3’5’Redb(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统；“线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。质粒:pSC101-BAD-gbaA(amp)pSC101-BAD-gbaA(tet)pSC101-BAD-gbaA(hyg)pSC101-Tet-gbaA(tet)pSC101-BAD-ETgA(tet)pSC101-Tet-ETgA(amp)RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异Red同源重组技术相关文献NatureGenetics(1998)NatureBiotechnology(2000)1.不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等；2.不受靶标DNA分子大小的限制；3.不受内切酶切位点的限制；4.精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、缺失、替换等的几率；5.简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩短实验周期。二、Red/ET同源重组技术的特点三、Red/ET重组的作用机制Red/ET重组链入侵模型1.链入侵模式Red/ET同源重组链退火模型2.链退火模型四、Red/ET重组中的功能元件1.Redα、Redβ和RedγRedα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白，5’-3’外切酶活性。Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanianetal.2003）Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。2.RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟基的底物也有活性。RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。3.RecA４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活力，增加电转化效率。五、Red/ET重组操作流程...