标记免疫分析VIP免费

§7.3标记免疫分析针对抗原-抗体反应缺乏高灵敏的定量检测信号的缺点，人们发展了在分析体系中引入探针系统-标记技术的方法，从而开创了微量和超微量分析的新天地。标记免疫分析是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原-抗体反应，从而间接测定微量的抗原或抗体。作为一种分析技术，标记免疫分析最早建立于1954年，它是由美国科学家R.S.Yallow和S.A.Berson利用放射同位素125I标记胰岛素，并使其与血浆中游离的胰岛素共同竞争有限的胰岛素抗体的特异性结合位点，最终形成的放射性抗原-抗体复合物与待测物含量呈线性负相关，应用-或-计数器进行检测，这种方法称为放射免疫分析法。该方法在当时及其随后的20年中是生物分析检测中最重要的成就，R.Yallow由此于1977年获得了诺贝尔奖。近年来标记免疫分析飞速发展，应用不同的标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷。常用的标记物有放射性同位素、酶、荧光素、化学发光试剂、镧系稀土元素等。与这些标记物相对应的免疫分析方法分别称为放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光免疫分析法（FIA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、时间分辨荧光免疫分析法（TrFIA）等多种。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的标记抗原或标记抗体，标记免疫分析又分为异相标记免疫分析和均相免疫分析两大类。§7.3.1异相标记免疫分析的基本原理异相标记免疫分析是一种需要在检测前分离游离的标记抗原或标记抗体的方法，它是医学检验中常用的方法。尽管目前已发展了许多涉及异相标记免疫分析的方法，在原理上它主要包括两种：其一是利用标记抗原与待测抗原共同竞争有限的抗体结合位点的竞争结合免疫分析；其二是标记抗体过量的非竞争性免疫分析。这些方法均有商品化试剂盒和自动化检测仪器。一、竞争结合免疫分析这一技术的基本原理是固定抗体的量，通过待测抗原与标记抗原间的竞争，获得可测定的免疫复合物，检测信号与待测抗原浓度成反比。任何可逆的特征键合蛋白质或细胞受体均可用此法进行分析测定。其过程可用下式表示：AgAgAb+Ab(7.3)Ag*Ag*Abk1k2其中标记抗原Ag*与抗体Ab的浓度或总量是固定已知的，达到平衡时与抗体结合的标记抗原Ag*的量与样品中抗原Ag的量成反比。利用标准曲线法可以测出待测抗原的量。当然在检测前需分离游离的标记抗原。二、非竞争免疫分析利用过量的标记抗体与待测抗原形成抗原－抗体免疫复合物。由于抗体过量，所有待测抗原均形成络合物，无需建立反应平衡：Ag+Ab*AgAb*+Ab*(7.4)形成的复合物与Ag浓度成正比。最后，分离已复合的Ab*和游离的Ab*进行测定。§7.3.2均相免疫分析均相法的最大特点是结合和未结合的抗原或抗体不需物理分离过程即可直接测定，使标记免疫分析更方便地实现自动化。最常用的体系是酶放大免疫技术（EMIT），这一方法对小分子（半抗原）如药物的测定特别有用。用酶标记抗原后，酶保持它的生物活性。当酶标抗原与抗体反应后，酶的活性由于空间立体阻碍或构象改变而被抑制（图7.7）。这种抑制随着游离抗原浓度的增加而减弱，因而酶的活性及其催化产物所给出的信号也就越强，利用标准曲线可测定抗原浓度。图7.7酶放大免疫技术检测原理示意图另一个均相免疫分析体系是利用磷光偏振技术，又称荧光偏振免疫分析（FPIA）。荧光物质经一平面的偏振光照射后，可跃入激发态，当其释放能量回到基态时，便发出偏振荧光。荧光偏振强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比。分子越大，旋转越慢，发出的偏振光越强。荧光偏振免疫技术中偏振光强度的变化如图7.8所示。例如，将荧光素标记的小分子药物和待测药物一起与该小分子药物的抗体混合。若体液中待测未标记的小分子药物浓度低，则标记的药物分子与抗体结合的就多，由于抗体分子大，所形成的荧光素标记的药物分子与抗体的结合物体积亦大，旋转减慢，荧光偏振光强度就高。反之，荧光偏振光强度就低。利用所产生的荧光偏振信号与待测物浓度成反比，通过标准曲线可以进行定量分析。图7.8FPIA原理示意图§7.3.3放射免疫分析如前文所述，放射免疫分析（RIA）是最早建立的标记免疫分...