蛋白相互作用研究技术VIP免费

第五章蛋白相互作用研究技术•蛋白相互作用是指两个或两个以上蛋白质分子，通过非共价键形成蛋白复合物的过程。•蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中。理解蛋白质相互作用的方式、作用程度、作用结果，将有助于蛋白功能分析、发育机制探索、疾病发生机制、药物研发等众多问题的解决。第一节酵母双杂交法•酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）：以酿酒酵母为实验宿主，基于对真核生物调控转录起始过程的认识和报告基因技术的发展而建立，是目前蛋白质相互作用研究的最有力工具。一、酵母双杂交系统的建立经典文献出处：•FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246.•1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）。•该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基于转录需要反式作用因子的参与，真核生物转录因子含有两个不同的结构域：•这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在时均没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活因子的功能。报告基因(reportergene)：•是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。•Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。•两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的147个氨基酸组成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence,UAS）。AD由位于C端的768-881位多肽构成。他们将Gal4的BD与酵母SNF1融合，将Gal4的AD与酵母SNF4融合，这两个蛋白已知是可以相互作用的。•当将两种重组质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，激活了UAS下游的报告基因LacZ的表达。酵母双杂交系统的基础元件：•与BD融合的蛋白----诱饵蛋白（bait）•与AD融合的蛋白----猎物蛋白或靶蛋白（preyortargetprotein）•基因组中整合了报告基因（reportergene）的酵母菌株----LacZ（编码B-半乳糖苷酶）（一）酵母双杂交实验原理用于鉴定蛋白质-蛋白质之间的互作•A蛋白（bait），B蛋白（prey），A蛋白和B蛋白可以互作•A蛋白融合调节蛋白的DNA结合结构域（BD），B蛋白融合调节蛋白的激活域（AD）•启动子带有调节蛋白结合位点的Reportergene•在酵母中单独表达任一融合基因，报告基因不表达•在酵母中同时表达两个融合基因，报告基因表达二、酵母双杂交系统的基本原理和用途•酵母双杂交技术在发展的过程中对报告基因、“诱饵”载体、“猎物”载体等做了很多改进。其中一个重要改进是引入了多个报告基因，如广泛采用的HIS3基因等。目前，大多数酵母双杂交系统往往同时使用2个甚至3个报告基因，但都含有最基本的lacZ基因。这种多重筛选提高了检测的灵敏度并减少了假阳性现象。α－半乳糖苷酶基因•Mel1：catalyzesthehydrolysisofmelibiosetogalactoseandglucose.Usingp-nitrophenyl-α-D-galactoside(PNP-α-Gal),acolorlesscompoundthatyieldsayellowproduct(p-nitrophenol)uponhydrolysis.（二）用途•一方面可以用于确认两个已知蛋白质的相互作用。•另一方面，更重要的是可以从cDNA文库中寻找与已知蛋白质相互作用的未知分子。该方法的优点：•一是具有很高的灵敏度，可以检测到生物化学方法检测不到的相对较弱以及瞬时的蛋白质相互作用；•另一个优点是在酵母的体内环境中进行分析，更接近天然状态。三、酵母双杂交基本实验步骤1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的...