第八章基因重组蛋白包涵体的复性解析VIP专享VIP免费

第八章基因重组蛋白包涵体的分离和复性北京化工大学谭天伟教授重组蛋白的复性概述包涵体的形成包涵体的分离纯化蛋白质复性方法基因重组蛋白包涵体的分离和复性包涵体的分离和蛋白质复性随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主外来宿主细胞中控制目的蛋白质的生产，细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生从而为临床和工业生产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质多肽产品。多肽产品。迄今为止，人们已经成功地实现了用多种迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核原核、真核表达系统表达系统生产基因工程蛋白生产基因工程蛋白基因工程表达产物后处理的特殊性8.1重组蛋白质大肠杆菌的重组菌有多种可选择的质粒；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；蛋白表达量高（可达总蛋白50％）；酵母易于糖基化和正确形成二硫键；表达产物分泌至胞外，易分离纯化；易于大规模培养和生产动物细胞产物分泌至培养液，易分离纯化；重组蛋白活性和天然蛋白一样；表达质粒易于得到；重组细胞可以大规模培养补充：蛋白质在E.coli中的表达E.coliE.coli表达系统优点：表达系统优点：操作方便操作方便遗传背景清楚遗传背景清楚廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短目的蛋白可获高水平表达目的蛋白可获高水平表达→→E.coliE.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那特别是对那些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白生物活性的基因工程蛋白51％8.2包涵体的形成在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体包涵体的形式的形式沉积于细胞内，表现为沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物无活性的不溶性聚集物包涵体：包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各各种原因种原因导致基因表达产物的导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约涵体。包涵体直径约0.5-1μm0.5-1μm，具有，具有很高的密度很高的密度（（约约1.31.3mg/mlmg/ml），相差显微镜下有），相差显微镜下有折光性折光性，呈，呈非水溶性非水溶性，，只溶于高只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。等。包涵体形成的几种可能性研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译后修饰酶及分子伴侣等)不足；4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。6）有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。减少包涵体形成的策略1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）等。3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。包涵体形成：有利因素1、包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40%2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使...