第二章沉淀法VIP免费

第二章沉淀法沉淀法（溶解度法）—是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀有机溶剂沉淀选择性沉淀第一节基本原理原理：根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水性基团和亲水基团之间的差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。一、盐析法原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。第二节沉淀的类型与操作一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）1）选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25％饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。2)经离心后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如25％-60％饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。1.盐的分级沉淀（1）盐类的选择常选用：硫酸铵优点：a.溶解度大，对温度不敏感，当水温25℃时，硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐的克数）为769克。当水的温为0℃时，其饱和溶解度679克。b.分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上c.有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化d.价格低廉，废液可肥田缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐（2）硫酸铵盐析的操作①固体加入法：在溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。注意：控制加入的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。②饱和溶液加入法是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算：V＝需加入硫酸铵溶液的体积（毫升）；V0＝原来溶剂的体积（毫升）；S1＝原来溶液的百分饱和度；S2＝要求达到的百分饱和度；S3＝需要加入硫酸铵溶液的饱和度（一般用100%的）。优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。③透析盐析法将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。缺点：只用于要求较精确、样品体积小的试验。2．盐析曲线的制作用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。具体步骤：取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。3.盐析的影响因子（1）盐析常数（Ka）蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：溶解度（S，以mg/ml表示）的对数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系，可用公式表示：lgS＝β-Ka·M式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度；Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。某一蛋白质的Ka值：与蛋白质本身的性质有关与溶液的pH、温度和盐的种类等有关(2)盐...