多聚酶链式反应扩增DNA片段总结VIP免费

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？12345DNA的基本单位－脱氧核苷酸DNA的基本单位－脱氧核苷酸OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键ATGCAGCTDNA分子的平面结构氢键5'端3'端5'端3'端DNA分子的复制过程是怎样的？DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸DNA复制的条件复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸一、基础知识（一）PCR原理：①在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性3、PCR原理②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出6、PCR技术的特点①PCR过程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸7、细胞内复制和PCR不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的细胞内DNA的复制PCR不同点解旋解旋酶，边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高温子链合成一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成相同点①需要提供DNA复制模板②四种脱氧核苷酸作为原料③子链延伸的方向都是从5’端到3’端细胞内DNA的复制与PCR的比较PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。（二）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列3、30次循环后靶序列扩增的数量循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,824二、...