放射免疫分析VIP免费

放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA）王海龙2006.032探讨的主要内容基本概念基本原理放射免疫方法的建立放射免疫分析的要求和影响因素免疫放射的基本概念放免分析的应用3第一节放射免疫概述4一、概念一种体外超微量分析法，它是将具有高灵敏度的放射性核素（如125I）示踪技术与高度特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。5二、基本原理1、标记抗原（Ag*）、非标记抗原（Ag）和特异性抗体（Ab）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争结合特异性抗体。Ag*+Ab=Ag*Ab+AgAgAb=62、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。73、将Ag*Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度，就可算出结合态的Ag*（B）与游离态的Ag*（F）的比值（B/F），或算出其结合率[B/(B＋F)]，这与标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。4、受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。8剂量反应曲线9放射免疫分析原理示意图10三、放射免疫测定的优点1）灵敏度高大分子，ng/ml水平；小分子，pg/ml水平。2）特异性好3）精确地定量4）操作方法越来越简便5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物质越来越多。11第二节放射免疫基本试剂12一、标准品标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求：(1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与抗体的亲和力和特异性应相同。(2)抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好的稳定性。13二、标记物1、标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。142、标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。125I是目前常用的RIA标记物。标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。15三、抗体（抗血清）抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选取特异性高、亲和力强及滴度高的血清，为RIA所用。16四、B与F分离剂以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）右旋糖酐T200.2g加0.1mol/LPBS至100ml电磁搅拌1h，然后置于普通冰箱待用。17五、缓冲液目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③Tris–HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。①保护蛋白②防腐剂③酶抑制剂④阻断剂⑤载体蛋白18六、试剂盒要注意的问题1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。2）标准品，抗血清、标记抗原要在-20℃以下保存，加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀，标记抗原最好当天溶解，当天使用。3）分离剂不能冷冻保存应保存在4℃冰箱内。4）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互使用。19第三节放射免疫测定20一、样品的处理血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。血清或血浆抽入试管-20℃保存3个月，-70℃保存6个月。21二、测定方法用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。22T：总放射性,只有标记抗原时的放射性。B0：待测抗原剂量为零时的最大结合。NSB：非特异结...