第二节免疫学诊断方法免疫学诊断：应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。抗原抗体反应T细胞杀伤反应补体介导的反应已报道的寄生虫免疫学诊断方法很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、补体结合试验，免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、放射免疫分析技术、免疫印迹技术等。此处仅介绍主要几种。一、间接血凝试验1.基本原理间接血凝试验(Indirectheamagglutinationassay，IHA)是将可溶性抗原或抗体先吸附于红细胞表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在适宜的条件下由于抗原抗体的特异性结合，会带动红细胞的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，称间接血凝试验。红细胞自然沉降，阴性被致敏的红细胞与被检血清反应，形成复合物，而不沉降，阳性（1）用微量滴管加4滴（25μl/滴）生理盐水于U型微量血凝板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。（2）第一孔内加待检血清，混匀，从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后吸出2滴，于第三孔和第四孔各加1滴，在第四孔混匀后弃去1滴，使第三孔和第四孔血清稀释度为1∶5和1∶10。（3）将冻干致敏红细胞用蒸馏水稀释后，用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔各加一滴（25μl），立即旋转震摇2min，室温下静置1h左右，观察结果。（4）判读标准以血清大于或等于1:10稀释出现阳性反应判为血吸虫病患者。二、免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescencemethod)又称荧光抗体标记技术(Fluorescent-labelledantibodytechnique)，是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。判定结果时，-为无荧光，+为荧光弱但清楚可见，++为荧光明亮，+++~++++为荧光强而明亮。A：++++；B：+++；C：:+；D：阴性对照目前，荧光免疫技术已在许多寄生虫病中得到应用。如血吸虫病、锥虫病、旋毛虫病、弓形虫病、利什曼病等。弓形虫速殖子抗原片的制备用适量生理盐水稀释弓形虫速殖子全虫，滴于载玻片上，显微镜下观察，至视野中的虫体均匀散在，每个高倍视野100个虫体左右（1×107/mL）。用移液器吸取上述稀释好的虫体30μL，滴于载玻片每个反应孔区内，静置30min，吸去孔区内多余的液体，空气中自然晾干后，冷丙酮固定10min，自然干燥5～10min，用锡纸包装后，4℃保存备用。弓形虫速殖子免疫荧光专用载玻片将待检血清稀释后，取30μL加入抗原片反应区内，置湿盒内室温反应30min，用PBS漂洗3次，每次5min，自然凉干。滴加用PBS稀释的FITC标记二抗30μL，湿盒内室温反应30min，同上洗涤、晾干。再加PBS稀释的伊文斯蓝（0.02%）30μL，湿盒内室温反应5min，PBS洗1次，5min，晾干。各反应区内滴加90%的磷酸盐缓冲甘油一滴，覆以盖玻片，荧光显微镜下检查。弓形虫IFA结果A：一抗1:60稀释时检测结果；B：一抗1:120稀释时检测结果；C：:一抗1:480稀释时检测结果；D：阴性对照检测结果三、免疫酶技术酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的。免疫酶技术在方法上分为两类，一类用于组织细胞中的抗原或抗体成分检测和定位，称为免疫酶组织化学或免疫酶染色法，另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。免疫组织化学标本制备后，先将内源酶抑制，然后进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与抗体法相同，只是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。直接法是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其抗原。在含有寄生虫或其抗原的标本固定后，消除其中的内源性酶，用酶标记的抗体（直标一抗）直接处理，使标本中的抗原与酶标抗体结合，然后加底物显色，进行镜检。间接法是将含有寄生虫或其抗原的组织或细胞标本，用特异性抗体处理，...
