抗体的制备及应用VIP免费

抗体的制备及应用一、抗体的一些基本概念单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体(PolyclonalAntibody)多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234Ag单克隆抗体B1B2B3B4B3B3B3B32多克隆抗体3411、单克隆抗体的特点特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！）因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。抗体的性质相同，容易纯化、标记。脑垂体分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素hLH促黄体生成素hTSH促甲状腺激素hCG#绒毛膜促性腺激素βαβααββα单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反应）,或有相似的表位（不同程度的交叉反应）。产生凝集反应的原理113323221111112232322113购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验,使用浓度多少•WB（Westernblotting，免疫印迹)•IH(Immunohistochemistry,免疫组织化学)•IC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)•IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫电镜)•FCM(FlowCytometry,流式细胞仪)•ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)2、多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。抗体的纯化、标记比单抗难因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多.二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备无法采用生物化学的方法从多抗中分离必须采用细胞杂交的方法来制备能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问题也有机遇问题制备单克隆抗体的基本原理：致敏的B淋巴细胞骨髓瘤细胞（myeloma）（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存）但能在体外长期生存）阳性杂交瘤细胞(hybridoma)（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体12222122、多抗的制备常用的免疫动物免疫的基本步骤如何免疫兔子1）常用的免疫动物•兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）•小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）•大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）•羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。•马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。•豚鼠（guineapig）：国外实验室常用。2）免疫的基本步骤•基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（ComplateFreund’adjuvand,含矿物油,卡介苗等).•加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。(在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g）基础免疫•0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原)•0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml）•制备抗原-佐剂乳化液•背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）加强免疫•间隔2-4周,可进行多次•0.5ml抗原(蛋白量减半)•0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)•制备抗原-佐剂乳化液•背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价•酶联法：1:104以上，能达到1:106。•免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64效价达到要求的可放血制备血清•可一次放血(颈动脉)•也可多次取血(耳静脉)单抗与多抗的区别单抗多抗抗体组成单一复杂抗体性质个体的属性群体综合的性质纯化标记容易，效果好难度高一些种属来源绝大多数是小鼠兔子、羊、豚鼠等制备...