第3章免疫原和抗血清的制备第3章免疫原和抗血清的制备医大一院检验科：崔华露本章内容第二节免疫佐剂第三节抗血清的制备第四节抗血清的鉴定和保存第五节抗血清的纯化第3章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫学检测免疫学检测//免疫学研究免疫学研究免疫学检测免疫学检测//免疫学研究免疫学研究抗原和抗体是免疫学检测的重要因素抗原抗体反应免疫原：免疫原：获得特异性抗体获得特异性抗体抗体：抗体：纯化抗原纯化抗原检测抗原检测抗原细胞细胞细菌细菌寄生虫寄生虫一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备三、人工抗原的制备第一节免疫原的制备天然抗原人工抗原颗粒性抗原颗粒性抗原蛋白质蛋白质多糖多糖脂类脂类核酸核酸可溶性抗原可溶性抗原人工结合抗原人工结合抗原人工合成抗原人工合成抗原人工重组抗原人工重组抗原免疫原：诱导机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。混合体须提纯一、颗粒性抗原的制备绵羊红细胞SRBC：常用，溶血素取颈静脉血，去除纤维蛋白，用无菌生理盐水洗涤3次，配制终浓度106/ml的细胞悬液。细菌性抗原的制备（菌液或固体培养物）：鞭毛抗原：菌液0.3-0.5％甲醛处理，菌体抗原：100oC2-2.5小时去鞭毛毒素抗原：杀菌后加0.5-1％CaCl2。二、可溶性抗原的制备：粗提组织匀浆制备①新鲜/低温样本②去除包膜/结缔组织/大血管③灌洗④剪成小块⑤匀浆机粉碎1000r/min⑥离心2000-3000r/min⑦去除微小碎片/组织可溶性抗原的制备：粗提细胞破碎细胞破碎方法原理操作要点适用范围不适用冻融法保内水分形成冰晶，内外浓度改变，破坏细胞膜和胞内颗粒-20℃/30-37℃速冻慢融反复2次组织细胞微生物超声破碎法液体局部减压引发内部液体流动，涡旋形成消失产生压力1-20kHz间歇进行组织细胞细菌/真菌酶处理法消化溶菌酶：G+纤维素酶：真菌蜗牛酶：酵母菌、植物微生物表面活性剂处理法与脂蛋白形成微泡改变细胞膜通透性SDS去氧胆酸钠二乙基十六烷基溴细菌核酸提取可溶性抗原的提取和纯化提纯细胞破碎后释放到胞外的成分：蛋白质、多糖、脂类、核酸蛋白质抗原的制备：①超速离心法：用于小部分大分子抗原②选择沉淀法：用于粗提（抗原和丙球）③凝胶层析法：根据分子量分离④离子交换层析法：根据电荷分离⑤亲和层析法：纯度高，不失活，纯化原理：比重差速离心：低速/高速交替（分离大小差别大的颗粒）密度梯度离心：不同沉降速率的颗粒在不同的密度梯度层内介质：蔗糖/甘油/氯化铯适用范围：大分子（IgM，C1q，甲状腺球蛋白）比重小的抗原：载脂蛋白A、B不适用多数中小分子超速离心法选择性沉淀法方法原理要点盐析沉淀法减弱蛋白质周围水化层；中和电荷，使分子聚集抗原粗提：33-50％硫酸胺提取丙球：将33-40％硫酸胺沉淀物去盐抗原浓缩：硫酸胺沉淀法有机溶剂沉淀法降低电离常数乙醇/丙酮0℃以下搅拌均匀聚合物沉淀法脱水破坏水化层PEG2000-6000IC：3-4%（最常用）IgM：6-7%IgG：8-12%其他Ig：12-15%Albumin：25%核酸去除法核酸沉淀/核酸降解氯化锰，硫酸鱼精蛋白++++++++++++++++++33-50%饱和硫酸铵盐析：经典的蛋白纯化技术层析法方法原理要点凝胶层析分子筛作用，分离分子量不同的蛋白固定相：凝胶流动相：含有不同分子量蛋白的待分离溶液离子交换层析带离子基团的离子交换剂，吸附交换带相反电荷的蛋白固定相：离子交换剂（树脂/凝胶/纤维素）流动相：含离子的待分离蛋白溶液亲和层析生物分子间专一亲合力特异性+可逆性抗原/抗体酶/底物（酶抑制剂）激素/受体凝胶层析分子筛层析：具有三维空间多孔网状结构的物质。++++++++++++++++++++++++++++++高分子聚合物-基质电荷基团-交换部分平衡离子带有电荷的纤维素或凝胶，吸附交换带有相反电荷的蛋白质抗原。由于不同蛋白质等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合不同。当不同离子强度的洗脱液洗脱时，不同蛋白质将被洗脱下来。离子交换层析亲和层析亲和层析支持物的选择：①非特异性吸附少②液体通过时流速快③各种pH和高盐时稳定④必须带有丰富的微孔，以增加结合容量电泳法原理：同一pH，蛋白质因分子量和电荷数量不同而在电场中迁移率不同。等电聚焦电泳IEF：...
