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PCR-RFLP基因分型方法---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析尹继业概念聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性(restritionfragmentlengthpolymophism，RFLP):是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。PCR-RFLP:是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。概念概念确定基因序列设计引物选择内切酶电泳基因型Stepbystep基因序列查找Exon1Exon2Exon3PromotergDNAcDNAPromoter基因序列查找http://www.genomatix.de/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbankhttp://expasy.org/sprot/基因序列查找选择gene输入基因名称基因序列查找基因的全称基因的物种来源基因序列查找cDNA序列gDNA序列基因序列查找序列如何详细区分每一个外显子和内含子？基因序列查找基因序列查找外显子全序列基因序列查找包含有该外显子的序列该外显子的全序列基因序列查找起始密码子外显子内含子启动子？启动子序列查找先免费注册登录启动子序列查找启动子序列查找选择Gene2Promoter启动子序列查找选择物种基因的名字启动子序列查找提交选择你的基因继续启动子序列查找启动子序列查找可以选择是否分析该启动子不同颜色代表该启动子序列的可靠性，金黄色代表实验研究证明启动子序列查找开始分析启动子序列查找继续提交点击获得序列启动子序列查找启动子序列查找详细序列如何确定我的SNP位置C218A：外显子编码方式rs431898：pubmedSNPs数据库编号C-256A：启动子编码方式如何确定我的SNP位置ATG的A是第一位C218AC-256A如何确定我的SNP位置选择SNP选项输入编号rs…….如何确定我的SNP位置该SNP附近的序列关于该SNPs的详细信息如何预知我的SNP的功能意义输入蛋白的名称如何预知我的SNP的功能意义如何预知我的SNP的功能意义如何预知我的SNP的功能意义结构域名称起止氨基酸编号该结构域的氨基酸长度如何预知我的SNP的功能意义多态性包括SNPs定点诱变研究氨基酸的改变是否有功能意义基因序列查找更多序列查找方法、查找途径、数据库信息和序列比对请参考引物设计引物设计引物一般原则基本原则：1.引物要跟模板紧密结合，2.引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，3.引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。需要考虑的因素：引物长度（primerlength）、产物长度（productlength）、序列Tm值(meltingtemperature)、ΔG值(internalstability)、引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）错误引发位点（falseprimingsite）、引物及产物GC含量（composition）引物一般原则引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp太短：特异性不好太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，引物3’端的碱基一般不用AA在错误引发位点的引发效率相对比较高，5’端序列对PCR影响不大，常用来引进修饰位点或标物。引物的GC含量：一般为40-60%，以45-55％为宜两条引物之间的GC含量不宜相差太大引物一般原则Tm值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最好相差不要大于5度引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5最好不要位于3’末端否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，如果在5’末端对反应就没有多大的影响了ΔG值:反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1000bp酶切后产物片断的大小差距：100bp以上引物设计工欲善其事，必先利其器PrimerPremier5.lnkPrimerPremier5.0引物设计Oligo.lnkOligo6.0引物评价引物设计新建窗口输入序列PrimerPremier5.0突变位点选取突变位点前后约500bp长度的碱基PrimerPremier5.0引物设计酶切位点分析PrimerPremier5.0自动搜索引物手动编辑引物PrimerPremier5.0前引物的位置（必须超过突变位点...