第二章蛋白样品的预处置VIP免费

第二章蛋白质样品的预处第二章蛋白质样品的预处理理PretreatmentofProteinSamplePretreatmentofProteinSample2.1蛋白质样品的总提取和粗分离方法2.2蛋白质样品的浓缩方法2.3蛋白质样品的透析2.12.1蛋白质样品的总提取和粗分离方法蛋白质样品的总提取和粗分离方法2.1.1细胞的破碎方法—蛋白质样品的总提取对于分泌到细胞外的目标蛋白，不需要破碎细胞，直接提取细胞的培养液进行后续分离纯化即可。如细菌和霉菌分泌的淀粉酶、蛋白酶等而对于只分布在细胞内的目标蛋白，首先需破碎细胞，使目标蛋白释放出来，才能进行后续的分离纯化。如线粒体中三羧酸循环酶系和氧化磷酸化酶系，核糖体中的蛋白质合成酶系等常用的细胞破碎方法有超声波法、珠磨法、高压匀浆法、冻融法、渗透压冲击法、酶解法2.1.1.1超声波法原理：•超声波是指振动频率>20000Hz以上的声波，其每秒的振动次数（即振动频率）超出了人耳听觉的上限（20000Hz），人们将这种听不见的声波叫超声波•常常利用超声波细胞破碎仪对细胞进行超声破碎，其原理是将电能通过换能器转换为超声波形式的声能，利用超声波产生的能量使细胞悬浮液中产生一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用•超声波细胞破碎法能用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎美国Sonics品牌超声波破碎仪，世界最著名品牌1.简洁、便携式，样品处理量0.15-150ml/1-1000ml2.微电脑控制，可根据样品自动调整到最佳的频率及超声波强度3.LCD参数显示及时间显示一般含：一般含：主机、主机、传感头、传感头、隔音箱隔音箱一般含：一般含：主机、主机、传感头、传感头、隔音箱隔音箱国产的超声波破国产的超声波破碎仪碎仪2.1.1.2珠磨法原理•利用固体间研磨剪切力和撞击使细胞破碎，是最有效的一种细胞物理破碎法•一般利用珠磨机进行操作•珠磨机的搅拌速度应限制在合适的范围以减少产生的热量，避免造成蛋白质的失活•珠磨法破碎细胞分为间歇或连续操作。珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，适用于绝大多真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎珠磨机（细胞破碎用）2.1.1.3高压匀浆法原理•细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上；细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作压力通常为50~70Mpa•影响因素：压力、循环操作次数和温度•高压匀浆法适用于酵母和细菌细胞的破碎•一般使用高压匀浆机进行操作高压匀浆机2.1.1.4冻融法原理•将待破碎细胞冷却至-15~-20℃，然后置于室温（或40℃）迅速融化；如此反复冻融多次，由于细胞中形成冰晶，以及剩余胞液中盐浓度增高而使细胞发生溶胀、破裂•优点：简单方便，适合于细胞壁较脆弱易破坏的微生物菌体•缺点：破碎率较低，如果目标蛋白对温度变化敏感不宜采用此法2.1.1.5渗透压冲击法原理•渗透压：将溶液和水置于U型管中，在U型管中间安置一个半透膜，以隔开水和溶液，可以见到水通过半透膜往溶液一端跑，假设在溶液端施加压强，而此压强可刚好阻止水的渗透，则称此压强为渗透压•高渗溶液：指渗透压高的溶液，如蔗糖溶液。一般溶质浓度越大，渗透压越高，水势能越低；水由高势能向低势能方向扩散。可做脱水剂•操作：将待破碎的细胞先置于高渗溶液中，再转入低渗溶液或水中，利用渗透压的变化使得细胞破碎举例：将0.5ml细胞悬浮液加入4ml含20%蔗糖，30mmol/LTris-HCl（pH8.0，1mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100）高渗溶液中，室温下静置5min后，10000rpm离心3min，收集细胞，弃上清。再加入2ml去离子水（低渗溶液），冰浴中温和搅拌10min，便可使细胞破碎，45000rpm℃离心3min，胞内蛋白即分布于上清中2.1.1.6生物酶解法原理•生物酶解法是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分（纤维素、半纤维素和果胶质）水解或降解，破坏细胞壁结构，从而达到破碎细胞目的的方法。如溶菌酶（破坏革兰氏阳性菌细胞壁）、蜗牛酶（破坏酵母细胞壁）等•优点：专一性强，操作条件温和，收率高•缺点：成...