ChIP实验精讲(做科研的必看)VIP专享

ChIP 实验精讲（做科研的必看） 染色质免疫共沉淀（ChIP） 概述 ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。 研究蛋白质与DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。 ChIP 是目前唯一研究体内DNA 与蛋白质相互作用的方法 原理 在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。 ChIP 应用 1、检测体内反式因子与DNA 的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系； 2、CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； 3、CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； 4、RNA-CHIP 用于研究RNA 在基因表达调控中的作用。 试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术 1. 细胞甲醛交联和收集 注意 事 项 ： ① 需 要 优 化甲醛使 蛋白质和DNA 交联的时 间 。 ② 交联的时 间 很 关键 。交联的时 间 一般 为 2-30 分 钟 。 ③ 交联过度会 降 低 抗 原的可 结合性和超 声 的效 率 ，也 会 被 遮 盖 抗 原的表位。 ④ 甘 氨 酸 可 抑 制甲醛的作用，终 止 交联反应。 1.1 取 1 直 径10cm 培 养 皿 的细胞。加 入 甲醛至 终 浓 度为 0.75%（V/V），使 蛋白和DNA 交联。 1.2 室 温 下，轻 摇 10 分 钟 。 1.3 加 入 甘 氨 酸 至 终 浓 度为 125 mM，室 温 下放 置 5 分 钟 ，以 终 止 交联。 1.4 吸 去 培 养 基，用冰 冷 PBS 洗 细胞2 次 。 1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS， 刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。 1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2 次，至 50ml 离心管中。 1.7 4℃，1000 g，离心5 分钟收集细胞。 1.8 吸弃上清，用 SDSLysis Buffer 重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加 800 μl）。 SDS Lysis Buffer 配方： 50 mM HEPES-KOH pH7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA pH8 1% Triton X-100 0.1% Sodium Deoxycholate 0.1% SDS Protease Inhibitors (每次新鲜加入) 注意事项：使用悬浮细胞实验时，加入0.75% （v/v）的甲醛和甘氨酸后，5 分钟...