双脱氧链终止法又称为Sanger法 原理是：核酸模板在DNA 聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性 P32 标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入 4 种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有 3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分 4 个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段 3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger 法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于 Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了 D NA 测序的速度和准确性。20 世纪 80 年代初 Jorgenson 和 Lu kacs 提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。 1992 年美国的 Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25 只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出 350 bp，DNA 序列,分析效率可达 6 000 bp/h。1995 年 Woolley 研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长 3.5cM，在9min 内可读取 150 个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列 自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的 D NA 测序仪。如 ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术 杂交法测序是20 世纪 80 年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和 Sanger 法, 而是利用 DNA 杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列 序检测速度快, 采用...
