T-载体连接全过程第一步：PCR 扩增目的基因及纯化1.PCR 反应体系：10X 扩增缓冲液5.0ul10mMdNTP1.0ul引物 11.0ul引物 21.0ul模板 DNA1.0ulTaqDNA 聚合1.0ul加双蒸水至50ul（相同的引物体系可配置 PCRMIX 体系）2.PCR 反应条件：PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。95°C5min95°C--、45s40〜60C--50s 循环 35 次72C--55s72C"lOmin3. PCR 期间配置琼脂糖凝胶：PCR 结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。4. PCR 产物回收（1）单一 PCR 产物用氯仿法•把 PCR 产物转移至 1.5ml 的离心管，加 500ul 无菌水，500ul 氯仿异戊醇（24:1）,混匀后 lOOOOrpm 离心 5-10 分钟•转移上清（约 400ul）至灭菌的新 1.5mL 的 Eppendorf 管，加入 2 倍体积（780 吐体积即可）的无水乙醇与 40ul3MNaAc。置冰上或-80C 冰箱30 分钟以上。•10000rpm 离心 10min。弃上清，沉淀用适量的 70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉。•置于恒温器上干燥（55°C）至无色透明或无乙醇气味，大至要 5~10min。•加入 40 卩 L 无菌水溶解沉淀备用。（2）多条带 PCR 产物用切胶回收试剂盒。•PCR 产物进行琼脂糖电泳（大容量上样系统）•切胶并回收目的条带至 1.5ml 的离心管，称重。•参照试剂盒说明书进行操作（附录 3）。•用 50ul 无菌水洗脱离心柱 2 次备用。第二步：T-载体连接和转化准备工作：制备感受态细胞，方法见附录一，LB 培养基，Amp 母液，氯化钙的配制，方法见附录二；1.在微量离心管（PCR 管）中配制以下体系：注：T-载体试剂盒开封前要向 pMD18-TVector 管中加入 25ul 无菌水，同时再管上面做标记。{ pMD18-TVector1.0ul外源 DNA1.5ulSolutionl2.5ul2. 16°C 或 4°C 低温连接 lh-2h（最好过夜）；3. 连接产物全量加入 50ul 的 DH5a 感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置 30min；DH5a 感受态细胞加 5ul0.1M 的无菌氯化钙做阴性对照；4.热击：42C 水浴中热击 90 秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷 2-5 分钟（禁止摇动）。5.复苏：向每管中加入预冷的 400MSOC 液体培养基（注：不含Amp）,混匀后 37C 轻摇培养 1~1.5 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。6.涂布平板筛选转化质粒：将上述各管培养液摇匀后取 50 卩 l 分别涂布于含 Amp 的筛选 LB 平板上。（注：1.将培养液摇...
