免疫组化操作规程

1 免疫组化操作规程 （一）、仪器设备 1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS 缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）：700ml 水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH 调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L 的TBS 缓冲液（pH8.0）：在800ml 水中溶解121gTris 碱，用1N 的HCl 调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N 的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2 溶液：用30%H2O2 和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4 适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60 分钟或60℃恒温箱中烘烤 20 分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟； 2）无水乙醇中浸泡 5 分钟； 3）95%乙醇中浸泡 5 分钟； 4）70%乙醇中浸泡 5 分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热 10~15 分钟。 （3）微波热修复 在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 5~10 分钟，反复 1-2 次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%...