原 位 杂 交技术的操作详解及小贴士 原 位 杂 交 技 术 应 用 于 染 色 体 、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技 术 的结合应 用 ，能将 DNA、mRNA 和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969 年 Pardue 和 Gall 将放射性标记的探针直接应 用于 纯化核酸的杂 交 ，此后得益于 分子克隆技 术 的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应 用 ，大大增加了原 位 杂 交 检测的应 用 灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于 地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原 位 杂 交 检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在 dUTP/UTP/ddUTP 上连接Fluorescein 后进行核酸标记。由于 标记在核酸上的荧光分子必须经受杂 交 和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于 衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应 用 了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色 。常用 的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体 或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应 检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987 年，由于 地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用 的地高辛抗体 不会结合于 其他的生物分子。这是相较于 生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体 金等，根据不同的应 用 需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于 引入了免疫检测反应 ，在放大检测灵敏度的同时，应 注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应 用 ，还可在同一样本中实现染 色 体 不同区域或细胞 样 本 中 不 同 RNA 序 列 的 多 重 检 测 。 原 位 杂 交 中 探 针 的 选 择 DNA 探 针 、RNA 探 针 和寡核苷酸探 针 均能通过不 同 的 酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探 针 的 长度较短，因此避免了探 针 内部退火的 问题，在杂 交 时的 渗透能力也更好，探 针 与靶标的 接触这是影响原 位 杂 交 是否成功的 重 要因素之一。 DNA探 针 、RNA 探 针 在合成时需要控制探 针 片段长度，通常 300-1000bp 左右，能覆盖到较长片段的 靶核酸序 列 ，增加检 测 的 灵敏度。 就 DNA 探 针 和 RNA 探...
