实时荧光基因相对表达数据处理△△CT

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理 相对定量△CT 和 2-△△CT 方法 一、实时荧光原理及其中的概念 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念 Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。 实时定量PCR 技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。qPCR 中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，因此在 PCR 每个循环的延伸(双链 图 2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。如下图 1： n 扩增曲线可以分为：图 3 1. 基线期 ：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基Rn 荧光信号量，n 为循环数 图 1：PCR 扩增曲线 图 2 ：双链发射荧光 线。 2. 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线 3. 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP 的消耗殆尽,不会再有新的DNA链产生了,就进入到平台期了 实时荧光PCR 中重要的概念：CT 、扩增效率 CT值（Cycle threshold value）：实时荧光PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。起 始 模 板 DNA量 越 多 ， 荧 光 达 到 域 值 的 循 环 数越 少 ， 即 Ct值 越 小 。 Log模 板 起 始 浓 度 与 Ct值 呈 线 性 关 系 。 扩增效率 E（efficiency）：理想的PCR 反应在指数期应该是 Rn=R0 * 2n（Rn，n 次循环产物量。R0，初始模板量。n，循环次数） 因为每扩增一次 PCR 产物就会变为上次的2 倍。但是在实际 PCR 扩增中E 基本在 0.65-0.9。因此每个 PCR 反应的效率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成 ：Rn= R0*（1+E）n 二、2-△△CT 数据处理的方法 基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细图 3 扩增曲线的分期 介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-△△CT法。用此...