实验一_蛋白质含量的测定

170 〔Ⅱ〕 实验部分 实验一 蛋白质含量测定法 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中 Bradford 法和 Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 10～20倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH  + 3H2SO4  2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH  2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入 CuSO4 作催化剂，K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 171 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6．25 即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适用于 0.2~ 1.0mg 氮，误差为 2％ 费时 8 ～ 10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非 蛋 白 氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白 质 而 分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双 缩 脲 法（Biuret ...