cDNA全长测序一、RNA提取（一）实验用品Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇（75%，现用现配）、RNase—free水、大量酒精、冷冻离心机、1ml、200微升、10微升枪及枪头、EP管、研钵、剪刀、药匙、卫生纸、冰盒、口罩、手套、工作服、棉手套、计时器（二）实验步骤1.选活力良好的贻贝，迅速剪入研钵中（尽量剪碎），加入液氮，迅速研磨成粉末状（研钵中可以事先加入液氮预冷）。2.粉末状后迅速加入1mlTrizol，研磨均匀呈液体状，0℃放置5min（蛋白质彻底裂解）。3.向1mlTrizol中加入0.2ml氯仿，用力振荡15s（涡旋），室温放置3min，4℃12000g离心10min。4.将上层水相（约500微升）移至一干净的EP管中，加入等体积（约600微升）异丙醇，混匀，轻轻颠倒几下，-20℃放置10min。4℃12000g离心10min。5.小心弃上清（直接倒，然后反扣到干净的卫生纸上），加入1ml75%乙醇，并混合样品（要使样品悬浮起来），4℃12000g离心5min。6.重复步骤5，最后空转一下，用枪尽量吸去剩余的酒精（在超净工作台上操作）。7.通风厨（工作台）中干燥，闻不到酒精味即可（2-10min），加30-50微升（50微升）DEPC水，室温20min，使RNA彻底溶解。8.0.1%琼脂糖凝胶检测（胶槽，胶板用酒精擦干净，换新鲜电泳液），140V电泳10min检测。（99V，33min）。9.紫外检测，RNA溶液立即-70℃冰箱保存。（动作要迅速，冰上操作，试验前准备要充分）以下｛｝中的可以不操作｛组织样品中总RNA中DNA的消除：（1）无RNA酶活性的DNase1（5u/uL）2uLRNaseInhibitor（40u/uL）0.5uL10×DNasebuffer5uL总RNA20-50uLDEPC水补充到50uL（2）37℃反应20-30min（3）加入50uLDEPC水（4）加入100uL（等量）的苯酚\氯仿\异戊醇25：24：1充分混匀（5）离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中（6）加入10uL（1/10量）的3MNaOAC（PH=5.2）（7）加入250uL的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min（8）离心回收沉淀，用70%的冷无水乙醇清洗沉淀，真空干燥（9）用适量的DEPC水溶解，电泳确认DNase1消化总RNA1-6uLBuffer1uL（RQ/RNase-Free10×ReactionBuffer）DNase2uL（RQ/RNase-FreeDNase）RNaseE抑制剂0.5uLor1uLNuclease-Free水调至10uL37℃温浴30min每个体系中加入1uLstopsolution65℃10min灭活DNase1｝二、反转录（一）变性0.2mlPCR管中依次加入总RNA（处理过的）1-2ugoligo(dT)2uL70℃热变性5min冰浴2min稍离心（二）反转录在已完成变性反应的PCR管中依次加入5×M-MLV反应缓冲液5uL无RNase的dNTP（2.5mM）5uL最后加RNaseE抑制剂1uL（2.5u）M-MLV反转录酶1uL（200u）无RNase水调节总体积至25uL轻弹管壁稍离心42℃反转录1h95℃5min灭活反转录酶三、actin检验cDNA内参引物—actionR（反）ActionF（正）体系：10×Buffer（promega）2.5uL——事先4℃Mgcl2（25mMpromega）1.5uL——事先4℃dNTP（2.5mMeach）2.0uL正向引物（10mMF）1.0uL反向引物（10mMR）1.0uLTaqDNApolymerase(5u/uLTakara)0.2uLPCR水15.8uLcDNA1.0uLn管cDNA检测：准备n个新小EP管，分别从反转录完的n个小离心管中吸取1uL到新EP管中，并把剩余的cDNA-20℃保存，其它成分配成mix，然后分装到n个新EP管中。条件：94℃5min20×94℃20S60℃1min72℃2min72℃10min4℃pause四、3’—RACE一扩体系：10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05cDNA(模板)1Taq0.25F(F1)（引物）0.5uL/管条件：94℃5min10×94℃45S60-56℃45S72℃1min20×94℃45S56℃1min72℃1min72℃10min16℃pause二扩体系：（5uL一扩产物稀释100倍，即加495uL水，到500uL）10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05Taq0.25F(F1)0.5uL/管稀释后的模板1uL/管条件：94℃5min30×94℃30S56℃45S72℃1min72℃10min16℃pause五、电泳检测（一）制胶一般，0.5g琼脂糖+50mL配电溶液微波炉溶解冷却后加10uLgenefinder混匀（三）点样一般，5uL样品ormarker加到1uL预染液上预染液的配制：genefinder/loadingBuffer=1/9（四）条件90-110V25-30min——？六、切胶纯化1.计算胶体积0.1g—0.1ml×P250℃溶解7min至完全溶解（一般加200uL×P2）2.摇晃2-3min3.溶解胶加入吸附柱中（700uL以内）（吸附柱和EP...
