总RNA的提取定量与RTPCRVIP专享

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 级临床八年制 组 别： 第二实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 (Title of Experimetn) 总 RNA 的 提 取 、定量与 RT-PCR 实验日期 (Date of Experiment) 11 月 27 日 实验地点(Lab No.) 第二实验室 合作者(Partner) 指导老师(Instructor) 总分 (Total Score) 教师签名(Signature) 批改日期 (Date) 【预习报告】 一 、 实 验 原 理 1)总 RNA 的 提 取 与 定 量 在 哺 乳 动 物 中 ， 平 均 每 个 细 胞 内 大 约 含 有 10-5μg RNA， 其 中 rRNA占 总 量 的 80%-85%， tRNA和 核内 小 分 子 RNA占 10-15%， 而 mRNA只 占 1-5%。 rRNA由 28S、 18S、 5S等 几 类 组 成 ， 这 些 RNA分 子 根据 密 度 和 分 子 大 小 ， 通 过 密 度 梯 度 离 心 、 凝 胶 电 泳 、 离 子 交 换 层 析 进 行 分 离 。 mRNA分 子 种 类 繁 多 ，分 子 量 大 小 不 均 一 ， 在 细 胞 中 含 量 少 ， 绝 大 多 数 mRNA分 子 （ 除 血 红 蛋 白 、 有 些 组 蛋 白 mRNA以 外 ） ，在 3’端 存 在 20-250个 多 聚 腺 苷 酸 (polyA)。 利 用 此 特 点 ， 用 oligo(dT)亲 和 层 析 柱 分 离 mRNA。 RNA分 离 的 方 法 有 ： 异 硫 氰 酸 胍 氯 化 铯 超 速 离 心 法 ， 盐 酸 胍 -有 机 溶 剂 法 ， 氯 化 锂 -尿 素 法 ， 蛋白 酶 K-细 胞 质 RNA提 取 法 等 、 异 硫 氰 酸 胍 -酚 -氯 仿 一 步 法 等 。 目 前 常 用 的 是 Trizol法 。 Trizol试 剂 适 用 于 从细 胞 和 组 织中 快速 分 离 RNA。 TRIzol的 主要成 分 是 异 硫 氰 酸 胍 和 酚 。 异 硫 氰酸 胍 属于 解偶剂 ， 是 一 类 强力的 蛋 白 质 变性剂 ， 可溶 解蛋 白 质 主要作用 是 裂解细 胞 ， 使细 胞 中 的 蛋白 ， 核 酸 物 质 解聚 得到释放。 酚 虽可有 效的 变性蛋 白 质 ， 但是 它不 能完全抑制RNA酶 活性，因此 Trizol中 还加入了8－羟基喹啉、 β-巯基乙醇等 来抑制内 源和 外 源RNase。 在 加入氯 仿 离 心 后， 溶 液分 为水相和 有...