总RNA的提取和检测

精品文档---下载后可任意编辑实验二 总 RNA 的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总 RNA 的方法；2.熟悉紫外吸收法检测 RNA 浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握 RNA 琼脂糖凝胶电泳方法并分析总 RNA 的电泳图谱；实验原理（一）概述1. 10-5 μg RNA/细胞含有 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5%2. mRNA 3’端存在 20-250 个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用 oligo(dT)亲和层析柱分离 mRNA。分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶 K-细胞质 RNA 提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。4.目前常用的是 Trizol 法。（二）Trizol 的主要成分 是一种新型总 RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 Trizol 中还加入了 8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA 在上层水相中。4.取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA。(三)总 RNA 的纯度检测原理： 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA 在 260nm 紫外光波长处有最大的吸收峰。 因此，可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度，OD 值为 1 相当于大约 40μg/mL 的单链 RNA。用 PH= 的 TE（tris HCl 缓冲液）稀释 RNA 样品 n 倍并以 TE 为空精品文档---下载后可任意编辑白对比，根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000实验步骤（一）样品处理与 Trizol 用量1.提取组织 RNA 时，每 50～100mg 组织（即××,约合）用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每 5-10×106 个细胞加 1mL Trizol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。3.培育贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol 进行消化、裂解，Trizol 体积按10cm2/mL 比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA 的前提；细胞数量与 Trizol 的比例，细胞的数量不能过多。)（二）操作步骤1.细胞中加入 1...