氨基酸测定方法

4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1 试剂的配制： 缓冲液的配制：配制 pH= 6.00 的 NaAc－HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取 1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于 250ml pH=6.00 缓冲溶液中，得到 C = 4.080 g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取 0.5g 茚三酮溶于 100ml 蒸馏水中，得到 5g/L 的茚三酮水溶液。 4.1.2 标准曲线的确定 分别准确移取 0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml 标准液于 8 个比色管中，用 pH=6.00 的缓冲溶液稀释到 5.00ml 再加入 1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热 10min。冷却到室温，用 7230型分光光度计在 569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3 样品的测定 稀释待测液于 0.24mg/ml—0.73mg/ml,调 pH 值到 6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在 0.24mg/ml—0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图 1： 0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.10.40.60.81.01.21.4吸光度加入标 液体积(ml) B 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热 10min，β-氨基丙酸标准溶液 5ml、茚三酮水溶液 1ml、缓冲溶液 pH=6.00 4.1.5 样品的测定分析 将待测的一批稀释 50 倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00 的缓冲液稀释到5ml 再加入1ml 茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3： 表3 样品的测定 Table 3 Determination of sample 待测液序号 待测液所对应的反应时间 吸光度A 1 10h 0.320 2 20h 0.710 3 22h 0.562 4.1.6 浓度对显色反应的影响: ...