恒温扩增技术的原理与用途探究 即通过对靶序列的特异性扩增,使其产生大量拷贝,以到达检测水平
主要包括以下技术
环介导等温扩增技术,又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术,是由 Notomi 等于 2000 年所开发的一种核酸扩增技术[7]
LAMP 的核心是具有链置换活性的Bst〔Bacillusstearothermophilus〕DNA 聚合酶的应用以及基于靶核酸 6 个特异性片段〔即 5’端的 F1、F2 和 F3 区和 3’端的 B3c、B2c 和B1c 区,其中 F2 区和 B2 区为目的扩增片段〕的 4 条特别引物的设计,分别为上游内部引物〔FIP,由 F1c 区和 F2 区组成〕、下游内部引物〔BIP,由 B1c 区和 B2 区组成〕、上游外部引物〔F3,由 F3 区组成〕及下游外部引物〔B3,由 B3 组成〕
整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段
⑴起始阶段:FIP 的 F2 序列首先和模板 F2c 结合,引导合成互补链;随后,F3 与模板 F3c 结合,在 BstDNA 聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有 FIP 的完好互补链
此单链 5’端F1c 和 F1 自我碱基配对形成环状结构
以此链为模版,引物 BIP 和 B3以相同的方式引导另一端链合成、链替换,从而形成哑铃状结构的单链
F1c 末端可自发引导补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构
此产物可作为下一阶段的起始物为 LAMP 基因的扩增循环提供模板
⑵循环扩增阶段:引物 FIP 与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延长,并释放出另一条链,;释出链游离 3c 端自身成环,引发链延长取代并释放 FIP 引导合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物
引物 BIP 和 FIP 与上述产物的茎环结合重复以上延长过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物
其最终产物为一系列长度不