外定向自我剪接机制的结果分析和验证一种DNA片断体外定向自我剪接机制的结果分析和验证

第一部分 文献综述1.1 限制性内切酶的发现与分类限制性核酸内切酶是识别生物体中特定 DNA 碱基序列并在该区域切割双链 DNA 序列的核酸内切酶[1-3]。目前发现的大多数限制性核酸内切酶都来源于细菌。它们在细菌中的生物学功能主要是通过切割入侵的外源 DNA 序列，防止异源 DNA 无法有效转录(例如噬菌体)，从而使外源 DNA 序列(生命体)失去生命力，但不会破坏细菌本身 DNA 的原始遗传信息，形成细菌体内一种天然的免疫防御机制。1.1.1 限制性内切酶的发现Arber[4](1962)在研究大肠杆菌时，提出细胞内限制和修饰作用的模型假说：一是可以识别 DNA 碱基序列的限制酶, 另一个则是可以识别与相应的限制酶相同的碱基序列的修饰酶，Yuan 和 Meselson (1968)证实了这一假设。Arber 等(1968)首次从大肠杆菌 B 株细胞中发现了第一个限制性核酸内切酶。Smith 等(1970)发现流感嗜血杆菌(H-aemo-philus influenzaed)可以在不降解自身DNA 情况下降解侵入细菌体内的噬菌体 DNA；通过纯化 DNA 水解酶，确定了其高度特异性识别序列和切割位点，并将其命名为 Hind Ⅱ，这是第一个被发现的Ⅱ型限制性内切酶。后续研究发现，Hind Ⅱ 酶切后的 DNA 片段可以重组，这种限制性内切酶逐渐成为研究基因组成、表达及功能的重要工具。限制性内切酶广泛存在于原核生物中。通过对原核生物基因组进行测序和分析，发现许多可编码限制性内切酶的基因，因而发现更多种类的限制性内切酶。在 1980 年代初期，通过克隆技术将限制性核酸内切酶基因进行异位表达，避免其原始细胞中其他核酸内切酶的污染，并提高了限制性内切酶的纯度和产量，其纯化过程也不断优化。1.1.2 限制性内切酶的分类根据切割位点识别序列之间的距离差异、激活因子的差异以及它们是否同时具有甲基化酶活性，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大类(图 1A、B)[5]。 基于限制性内切酶的切割特征可分为两种类型：非特异性切割位点和特异性识别的核苷酸序列(仅特定序列可被切割)。可以特异性识别的切割位点应具有回文序列，即在切割位点，沿一条链的正向读取的碱基序列与另一条链的反向读取的序列相同。又根据限制性内切酶在特定切割部位的不同切割方法，可分为位错切割和平面切割。位错切割是指切割两条 DNA 链的不同部分，中间被几个核苷酸隔开，切割末端形成类似回文结构的单链末端，该末端与具有互补碱基的靶基因片段相连，因此称为粘性末端，如 BamH I 等。平面切割指...