UNG酶在PCR中的作用

UNG 酶在 PCR 中的作用UNG 酶Uracil-N-glycosylase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶原理：UNG 酶的作用原理是选择性水解断裂含有 dU 的双链或单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失硷基的 DNA 链在硷性介质，高温下会进一步水解断裂，从而被消除.UNG酶的最佳活性温度为 50℃，95℃灭活。作用：为保证 PCR 结果的准确性，要预防非特异性 PCR 扩增和污染。常用的措施是使用 UNG 酶(Uracil-N-Glycosylase)和 Taq 酶热启动。PCR 反应最常见， 最重要的污染物是PCR 产物，防污染热启动 PCR 试剂盒以 dUTP 取代 dTTP，所以 PCR 产物都是含有 dU 的 DNA 链在 PCR 开始前增加 50℃的保温步骤，UNG 酶即可将反应体系中已有的 U-DNA 污染物中的尿嘧啶硷基降解，并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂，消除由于污染 DNA 产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时 UNG 酶被灭活，不会再降解新扩增的产物 U-DNA。高品质的 UNG 酶可以消除高达 108 的 U-DNA 产物，和热启动 Taq 酶一同用于建立含有UNG/dUTP 防污染体系的热启动 PCR 反应系统。 UNG 酶特征 • 克隆有 Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。分子量 25.66 KDa。 • 反应条件： 50 ℃ ，2 分钟；反应 buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于 UV 照射的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理：在 PCR 产物或引物中用 dU 代替 dT。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键，可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链 DNA中消除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP 法：用dUTP 代替 dTTP，使产物中掺入大量 dU。在再次进行 PCR 扩增前，用 UNG 处理 PCR 混合液即可消除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含 dU 的新的 PCR 产物。3. dU 引物法：合成引物时以 dU 代 dT，这样 PCR 产物中仅 5ˊ端带 dU。UNG 处理后，引...