罗氏(Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD 法)一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中 断 裂 DNA 的 3’-OH 末 端 ， 并 与 连 接 辣 根 过 氧 化 酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以与通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材：光学显微镜与其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器与枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2 号（紫盖）Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、 3 号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自 备 试 剂 ： PBS 、 双 蒸 水 、 二 甲 苯 、 梯 度 乙 醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K 工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加 TUNEL反应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用 Proteinase K 工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C...
