蛋白质定量的五种方法

蛋白质定量得五种方法方法一 双缩脲法测定蛋白质浓度 [目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制。 [原理] 双缩脲（NH2C Ｏ NHCO Ｎ H2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物,称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—ＣＯＮ H—)在碱性溶液中也能与 Cu ２＋反应产生紫红色化合物。在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一.操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差，而且特异性不高.除—CONH—有此反应外—C Ｏ N Ｈ 2、—C Ｈ 2ＮＨ 2、-CS－N Ｈ 2等基团也有此反应。 [操作］ 取中试管 7 支，按下表操作． 各管混匀、放置 37℃水浴中保温 20 分钟.用 5 ４ 0n ｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。 [计算］ （一）在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L),并求出人血清样本得蛋白质浓度. （三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L)。 [器材] 中试管 7 支,l 毫升刻度吸管 3 支,10 毫升刻度吸管１支，水浴箱，７ 21 型分光光度计、坐标纸。 [试剂］ (—)6 Ｎ NaOH:称取 240 ｇ氢氧化钠溶于 1000m ｌ水中。 (二）双缩脲试剂:称取 CuS04·5H ２O 3。0 克,酒石酸钾 9.0 克与碘化钾５.０克,分别溶解后混匀,加 6 Ｎ Na Ｏ H l00m ｌ，最后加水至 1000m ｌ,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存.如有暗红色沉淀出现,即不能使用. （三)０、９%N ａ Cl． (四）蛋白质标准液(１ 0 ｍ g／ｍ 1),称取干燥得牛血清蛋白 100、０ m ｇ，以少量生理盐水溶解后倒入ｌ 0ml 容量瓶中，淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成ｌ 0mg/ｍ 1 作为蛋白质标准液。 （五)待测血清样本:将人血清或动物血清用生理盐水稀释１ 0 倍后再测定。方案二 Foli ｎ-酚试剂法(Lowry 法)测定蛋白质浓度 [目得］掌握 Lo ｗ ry 法测定蛋白质浓度得原理. [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与 C ｕ 2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂得磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度得线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白...