大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化VIP专享

大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化(7 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。2.掌握质粒 DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒 DNA 的原理。二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培育物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源 DNA 而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体 DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的 DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源 DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来 DNA 分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短临时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来 DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使 DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体 DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受 DNA 的酶 位点，使 DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探究，试图从实验中获得明确回答。有人根据 pBR322 质粒 DNA 对 E・coli K――12X1776 菌株的转化结果，认为：近来，在许多讨论室都发现 CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在 pH6.0 的 100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过 24 小时，转化率测恢复为原来的水平。（二）重组 DNA 的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的 DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或 DH5α，必须不同外来 DNA 分子发生遗传重...