PCR技术及其应用实例和前景分析研究 环境工程专业VIP免费

PCR技术及其应用实例和前景分析研究环境工程专业摘要：PCR(ploymersechainreaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大1引言人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(MedicalMicrobiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(ChemicalIndustry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(MedicalScience)、环境监测(EnvironmentSupervise)分子克隆(MemberClone)、序列分析(AlignmentAnalysis)、考古研究(ArchaeologySearch)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的PCR技术。2PCR技术原理下面我通过摘录了一个实验[2]，来介绍一下PCR技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。.在94°C高温下双链变性，分离出DNA单链的模板，然后降温(55°C)，然添加的与DNA单链配对，紧接着温度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板DNA被大量复制。在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方：(1)在配置PCR反映体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后加入，因为有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反应较强，反映体系如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。(2)非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。以上实验可清楚明了地向我们展示PCR技术的原理。3PCR技术分类PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历了20年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的PCR技术[3]3.1反转录PCR反转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)即以RNA分子为模板的扩增技术，主要用于克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针机构建RNA高效转录系统。3.2定量PCR定量PCR(quantitativePCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种PCR产物之间的数量关系。另外定量PCR还有广义和狭义之分[4]，在此就不详细介绍了。3.3实时荧光定量PCR所谓实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。3.4重组PCR重组PCR(recombinantPCRRP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同的碱基。利用重组PCR可造成DNA片段的碱基插入或缺失，从而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR反向PCR(inversePCRIP-CR)是对一个已知的DNA片断序列两侧的未知序列...