人胰岛素的制备

人胰岛素的制备一、 获得目的基因从供体细胞中提取 mRNA，以其为模板,在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素 mRNA 互补 DNA，再以 cDNA 第一链为模板，在反转录酶或 DNA 聚合酶 I 的作用在，最终合成编码它的双链 DNA 序列。即得到了目的基因。反转录—聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的 mRNA1， 细胞总 RNA 的提取 :取胰岛 B 细胞，用 PBS 洗后，加入 TRIZOL 试将细胞破裂,后用 DEPC 处理，多次离心后，取 RNA 白色沉淀，测 OD 值,电泳.2 ，从总 RNA 中分离 mRNA：取上述提取的总 RNA 若干，加入 Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀. 70℃水浴（裂解 RNA 的二级结构）， 20-30℃条件下，静置(让 Oligotex与 mRNA 结合）。 将 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀加到 EP 管 SPIN 柱上高速离心，加 Buffer 将其他 RNA 洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRNA。（二）mRNA 转录合成 cDNA 第一链cone 第一链的合成 加入上步获得的 mRNA 和适当引物于 EP 管中，加入 RNase-free water，混匀后，70℃反应 10 分钟,反应完成后,立即将反应体系置于冰上 5min;略微离心一下，顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验）， 混匀，略微离心反应物之后，42℃放置 2 分钟。取出置于冰上。电泳分析,同位素活性测定。（三）PCR 法扩增，特异合成目的 cDNA 链通过胰岛素的特异引物，用 PCR 法进行扩增，特异的合成胰岛素的 cDNA链 .PCR 法的操作步骤:预变性引物退火引物延伸循环 25-35 次最后延伸前端引物：5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc—3'后端引物:5’—agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、 组建重组质粒采纳 pQE—-30 质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。１。双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体 DNA 和外源 DNA 片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组 DNA 分子，从而实现 DNA 的定向连接。２。重组过程pQE-—30 用 Hind Ⅲ 和 BamHⅠ 酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源 DNA 片段同样也用 Hind Ⅲ 和 BamH...