生化技术理论与实践实验指导（四年制制药工程专业）生命科学与工程学院制药工程系张新国编写二零一零年六月实验一管碟法测定抗生素效价一实验目的·了解管碟法的原理。·掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。二实验原理抗生素效价：抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。抗生素的剂量常用重量和效价来表示。化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价以“单位”(U)来表示。抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈（图实验-18）。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。(1)求出W和V：(2)W=（SH+UH）-（SL+UL）(3)V=（UH+UL）-（SH+SL）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径UL：供试品低剂量之抑菌圈直径SH：标准品高剂量之抑菌圈直径SL：标准品低剂量之抑菌圈直径求出θ：（2）θ=D·antilog（IV/W）式中：θ：供试品和标准品的效价比D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。求出Pr：(5)Pr=Ar×θ式中：Pr：供试品实际单位数Ar：供试品标示量或估计单位当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。三实验材料-材料和仪器（1）细菌：短小芽胞杆菌[CMCC（B）63202的芽胞悬液。（2）培养基：效价检定用培养基（上层、底层）。（3）抗生素：抗生素检品及标准品（高剂量、低剂量，高剂量与低剂量之比为2:1）。（4）试剂与器材：灭菌生理盐水，无菌平皿，牛津杯，无菌吸管，镊子，滴管，直尺。四实验方法（1）取无菌平皿，加入20ml底层培养基，凝固后作为底层。（2）用灭菌生理盐水将短小芽胞杆菌的芽胞悬液稀释至一定浓度以能得到清晰的抑菌圈，且标准品高浓度所得抑菌圈直径在18-22mm为基准。用无菌吸管吸取1ml芽胞悬液，加入到200ml恒温于50℃的上层培养基中摇匀，迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，铺平待凝。（3）在平板底部四边，分别对角注明“SH”、“SL”和“UH”、“UL”标记。（4）镊子火焰灭菌3次，然后夹取4个牛津杯垂直放置在平板中标志附近（注：勿使钢管陷入培养基内，各小杯之间尽量等距）。（5）以无菌滴管分别在每个牛津杯内加入相应的抗生素溶液至满但不溢出管外，且四杯内液面高度相同，盖上平皿盖，静置30分钟。（6）将平皿置于37℃恒温培养箱培养16-18h，量取各抑菌圈直径（SH、SL、UH、UL），以毫米为单位...
