梅花鹿鹿角盘蛋白的分离纯化及其对大肠杆菌抑菌机制的初步研究 药学专业VIP专享VIP免费

摘要鹿角盘也称鹿花盘、鹿角帽，一般是鹿茸被锯根部残留骨化后于次年春天自然脱落的残角，常见于梅花鹿和马鹿，因其形状如盘而得名。早在汉代中医四大著作之一的神农本草经中就有关于鹿角盘的记载。《本经》：其主恶疮痈肿，逐邪恶气，留血在阴中。可经水煎熬浓缩成鹿角胶，起到滋补肝肾的功效，与鹿茸相比效果稍逊，但相较于鹿角而言具有奇效。鹿角盘具有有益身心、化瘀等功效，在医疗、保健、入药等多个领域作用广泛。因此对于鹿角盘更加深入的研究有利于鹿角盘产业的开发。鹿角盘主要功能成分之一引起了我们的关注，它就是蛋白质，生命物质基础和机体细胞组织的重要组成部分。所以，这次课题的切入点使蛋白质，在鹿角盘寻找生物活性蛋白，并对它的作用机制进行第一步研究，旨在为鹿角盘这一珍贵的动物药材的开发利用提供数据支持。本实验采用水溶液冷提法、SephadexG-25凝胶除盐等一系列方法得到梅花鹿鹿角盘总蛋白除盐品，对鹿角盘总蛋白除盐品进行SephacrylS-100凝胶过滤层析分离得到具有抗菌活性的蛋白组分，再进一步利用反相高效液相层析技术分离得到相应的抗菌蛋白，分别运用以下方法对鹿角盘总蛋白及抗菌蛋白进行鉴定和分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测分子量分布、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、反向高效液相等；根据实验室前期抑菌活性实验的工作基础选取大肠杆菌为实验菌株，微量肉汤二倍稀释法测定鹿角盘蛋白的抑菌效果，确定总蛋白和抗菌蛋白最小抑菌浓度；在此基础之上，运用纸片扩散法更为直观的观察其抑菌程度。利用流式细胞仪和扫描电子显微镜等测定对大肠杆菌细胞膜渗透性、细胞壁完整性和对菌体氧化应激的影响。结果表明：鹿角盘总蛋白除盐后蛋白含量为90.3％，经SephacrylS-100HR凝胶层析获得分子量＜20.1kDa的蛋白组分S2对大肠杆菌具有抑菌活性，将S2（＜20.1kDa）组分通过反相高效液相得到抗菌蛋白18.963kDa，纯度为87.12％。抗菌蛋白在浓度为5mg/mL时对大肠杆菌具有最小抑菌浓度，抑菌圈直径为10.8±0.2mm达到中敏；处理组在一定时间内电导率、β-半乳糖苷酶活性的显著差异表明细胞膜通透性受损；扫描电镜发现抗菌蛋白作用后菌体出现变形、塌陷、皱缩、破碎，荧光显微镜观察PI单染处理组荧光强度增强，说明抗菌蛋白破坏了大肠杆菌细胞膜细胞壁的完整性；菌体经2MIC抗菌蛋白处理2h，流式细胞仪检测ROS表达量为69.3％，显著提高菌体氧化应激水平，从而对大肠杆菌起到一定的抑制作用。关键词：鹿角盘；蛋白；分离纯化；大肠杆菌；抑菌机理AbstractAntlerplateisthebonepartleftaftertheantlerofsikadeerorreddeerwassawedoff.Itwillfalloffnaturallywhentheantlergrowsoutinthenextspring.Becauseofitsshape,itiscalledantlerplateordeertray.AsearlyasintheHanDynasty,oneofthefourmajorworksofChinesemedicine,thereisarecordofantlerdiscintheShennongMateriaMedicaClassic."TheSutra":itsmainevilsores,carbuncle,chaseevilgas,leavingbloodintheYin.Itcanbecondensedintoantlergluethroughwater,whichhastheeffectofnourishingliverandkidney,addingessenceandstoppingbleeding.Itisnotasstrongasantler,butitisbetterthanantler.Theremainingboneresidueisantlercream,whichhastheeffectofwarmingkidneyandhelpingYang,astringencyandhemostasis.Antlerdisciswidelyusedinthetreatmentofmastitis,mammaryglandhyperplasia,gynecologicalinflammation,enteritis,gastritis,soreswelling,lumbarcoldpain,etc.Italsohastheeffectofstrengtheningtendonandbone,promotingbloodcirculation,removingbloodstasisandsoon.Therefore,thedevelopmentandutilizationofantlerdischasagoodprospect.Proteins,oneofthemainfunctionalcomponentsoftheantlerdish,havealsoattractedextensiveattentionbecausetheyarethematerialbasisoflifeandanimportantcomponentofbodycellsandtissues.Therefore,thisprojecttakestheproteinastheentrypointtosearchforthebioactiveproteinintheantlerdishandconductapreliminarystudyonitsmechanismofaction,aimi...