64生物化学方法及其在中医研究中的应用-6VIP免费

第1页共6页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共6页第六章第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用一．生物化学的主要实验方法有哪些？答题要点：（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段：1．材料选择。原则是：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要注意取材新鲜，要进行预处理，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行，防止生物大分子的变性、失活。2．细胞破碎。生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据材料来源及实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。3．亚细胞器的分离。各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例，DNA几乎全部在细胞核中，电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网（微粒体）上，Na+-K+-ATP酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分离亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分离，一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。4．提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。5．分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。6．浓缩、干燥及保存。经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保存，有时还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。（二）离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。常用的离心机有多种类型，一般低速离心机的最高转速不超过6000rpm，高速离心机在25000rpm以下，超速离心机的最高速度达30000rpm以上。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：1．差速离心法。通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。2．密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的第2页共6页第1页共6页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共6页梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离...