大肠埃希菌检查法VIP专享VIP免费

大肠埃希菌检查法EscherichiaColiTestMethod1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。3.责任者QC化验员。4.程序：4.1.简述4.1.1.大肠埃希菌(Escherichiacoli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。4.1.2.用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。4.2.仪器、设备及用具4.2.1.无菌室4.2.2.净化工作台4.2.3.培养箱(36±1℃)4.2.4.高压蒸汽灭菌器4.2.5.显微镜(1500X)4.2.6.微波炉4.2.7.恒温水浴（45±1℃）4.2.8.离心机(500～4000r/min)4.2.9.0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器4.2.10.电冰箱4.2.11.匀浆仪4.2.12.366nm紫外灯4.2.13.玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1.0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。4.3.2.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。4.3.3.甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。4.3.4.V-P试液α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。4.3.5.革兰染色液4.3.5.1.结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。4.3.5.2.革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。4.3.5.3.脱色液95％乙醇4.3.5.4.沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。4.3.6.亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。4.3.7.溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)4.3.8.酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。4.3.9.曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。4.3.10.无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯801ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。4.3.11.无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000m...