DNA的分离纯化及测定VIP免费

第一章DNA的分离、纯化及测定第一节DNA的提取一、提取程序的原理植物DNA的提取程序应包括以下几项；1，破碎(或消化)细胞壁释放出细胞内容物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉，或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA时则应采取较为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，o人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4C匀浆的方法来破壁。2、破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。3、去除RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50—l00kb的DNA。在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNaseA除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。（植物分子生物学----实验手册（英）ClarkeM.S.主编顾红雅瞿礼嘉主译高等教育出版社1998）二、基因组DNA的提取1、基因组DNA用途DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序,Southern杂交|,基因文库的构建，PCR扩增等，高分子量和高纯度的基因组推荐精选DNA是非常重要的前提.2、基因组DNA提取的原则保证提取的DNA具有一定的长度纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染3、基因组DNA-CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度(0.3mol/LNaCl)溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性,在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（三(羟甲基)氨基甲烷）(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;2+2+EDTA螯合Mg或Mn离子,抑制DNase活性;NaCl提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.(Fromwebmodified)方法1——液氮——1×缓冲液：50mmol/LTris-HClpH8.0,0.7mol/LNaCl,10mmol/LEDTApH8.0,1%CTAB,20mmol/L2-巯基乙醇（用前加入）——氯仿/异戊醇（24：1）——RNaseA:2000U/mL用0.15mol/LNaCl,0.015mol/L柠檬酸三钠配10mg/mL;使用前100℃热处理15min,除去残留的DNase活性推荐精选——异丙醇，推荐精选——76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠——70%乙醇——TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTApH8.0,操作程序1.向装有700~800mg磨碎的干燥植物组织（冰冻干燥法，或用食品脱水器45℃~55℃用温暖干燥的气流对植物组织处理12h以上）（最好是去淀粉处理的：收获之前将植株暗处理24h）的50mL聚丙烯离心管中加入20mL65℃预热的1×CTAB提取缓冲液。轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65℃温育90min,并不时轻轻转动离心管。或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，在...