病毒RNA提取与纯化说明书VIP免费

集美大学生物工程学院生物0611黄自成QIAampUltraSensVirusHandbook（用于从1ml悬液样品中高效纯化可滤性病毒RNA或DNA，2003年1月）1试剂盒（250份）纯化柱250接收管2ml750AC缓冲液230mlAR*缓冲液90mlAB缓冲液(浓缩)22mlAW1*缓冲液(浓缩)95mlAW2*缓冲液(浓缩)66mlAVE缓冲液10×2ml蛋白酶K6mlCarrierRNA5×310μg2保存2.1纯化柱室温保存（15—25℃，以下室温保存均指该温度），保质期12个月2.2干粉状CarrierRNA可室温保存1年；而溶于AVE缓冲液时需要等分，可于-20℃保存1年2.3蛋白酶溶液可室温保存1年，但于2—8℃环境下可延长保存期3安全3.1衣着：合适的实验室外套、一次性医用手套、护目镜3.2注意事项3.2.1勿将漂白剂或酸溶液直接加入样品准备废液中，当AR缓冲液和AW1缓冲液含有的胍氢可酮和漂白剂结合时会产生高敏性的有害混合物3.2.2缓冲液AC、AB、AR、AW1和蛋白酶K均具潜在危险性，操作时需认真谨慎3.2.3所有实验步骤均需在室温（15—25℃）下进行；样品液可于2—8℃下保存6小时，在-20℃或-80℃下保存更长时间；同时，样品需先用内部控制物处理，以防核酸酶降解3.2.4纯化柱（防交叉污染）3.2.4.1加入样品液时勿弄湿柱子边缘3.2.4.2注意更换有屏障的无核酸酶枪头3.2.4.3防止用枪头触碰柱膜3.2.4.4稍离心除去盖上液滴4、设备与试剂4.1乙醇（96—100%）4.2无菌、无核酸酶、有屏蔽的枪头4.3无核酸酶离心管（1.5ml和2ml）4.4一次性无粉手套4.5磷酸盐缓冲液（PBS,当样品样不足1ml时）4.6可调速微型离心机（250—1200×g）厦门市疾病预防控制中心R○TM集美大学生物工程学院生物0611黄自成4.7振摇孵育器，可加热4.8试剂准备4.8.1CarrierRNA每管加入310μl缓冲液AVE，制成1μg/μl溶液，-20℃保存（冻融不能超过3次），每样品最优CarrierRNA量为5.6μg4.8.2缓冲液AB加入标明的乙醇体积（96—100%），翻转10次，使得溶液均质，室温保存4.8.3缓冲液AW1*加入瓶上标明的乙醇体积（96—100%），室温保存*4.8.4缓冲液AW2加入瓶上标明的乙醇体积（96—100%），室温保存5、流程5.11ml处理液5.2细胞溶解，目标物沉淀于缓冲液AC中5.3在缓冲液AR中重新悬浮，并用蛋白酶K除去蛋白5.4加入缓冲液AB，连接，清洗2遍，洗提获得RNA或DNA6、实验操作步骤6.1准备6.1.1使样品液温度平衡至室温（15—25℃）6.1.2校核缓冲液AB、AW1、AW2、CarrierRNA等6.1.3使AR缓冲液温度平衡至60℃（水浴锅）6.1.4所有离心操作需在室温下进行6.2吸取1ml样液至2ml离心管中（管盖上不能有液体粘附，防污染）若不足1ml，需用磷酸盐缓冲液补足，但样液体积应不少于200μl6.3吸取0.8ml缓冲液AC至样液表面；吸取5.6μlCarrierRNA液体至管盖（6.1μlmix）勿将缓冲液AC和CarrierRNA事先混合，且需加入内部控制物，同时推荐与CarrierRNA混合加入（0.5μl+5.6μlCarrierRNA），即6.1μlmix6.4盖上盖子，上下翻转3次，涡旋10秒6.5室温孵育10分钟（最多15分钟，不能更久）6.6离心3分钟（1200×g），移除表面液体，收集沉淀（轻弹使沉淀松散，确保盖上无碎物）6.7移入300μl预热至60℃的缓冲液AR和20μl蛋白酶K为了减少移液步骤，可将缓冲液与蛋白酶K混合，若10份，即3.3ml预热缓冲液AR和220μl蛋白酶（多10%），漩涡10秒混合后，分装320μl至每管6.8漩涡至微粒完全重新悬浮每次漩涡两管（5—10秒），后漩涡另两管，反复循环3—5次（或更多），有助于蛋白消化6.9在振摇孵育器上孵育10分钟，40℃，最高混匀速度10分钟已足够长，不允许延长时间6.10稍离心，除去盖上液滴6.11移入300μl缓冲液AB，漩涡混匀，稍离心厦门市疾病预防控制中心集美大学生物工程学院生物0611黄自成6.12小心移取700μl溶解物至纯化柱（装在一2ml收集管上），勿弄湿边缘，盖上盖子，离心1分钟（3000—5000×g）6.13将纯化柱装在新的2ml收集管上（试剂盒中提供），遗弃旧收集管；小心打开纯化柱盖子，移入500μl缓冲液AW1；离心1分钟（6000×g）6.14将纯化柱装在新的2ml收集管上（试剂盒中提供），遗弃旧收集管；小心打开纯化柱盖子，移入500μl缓冲液AW2；最高速离心3分钟（20,000×g）为防止离心减速震动导致的滤液黏着在纯化柱上，可额外取一新2ml收集管套上纯化柱，...