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植物细胞骨架光学显微镜观察VIP免费

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植物细胞骨架的光学显微镜观察黄斌谢卓文徐安乐钟建良邹天生(中山大学生命科学学院00级生物科学专业,广州510275)【摘要】本实验根据细胞骨架的特性,利用适当浓度的TritonX-100处理洋葱鳞茎内表皮细胞,破坏细胞内大多数蛋白质而保存细胞骨架系统,再经考马斯蓝染色,在光学显微镜下观察细胞骨架,对细胞骨架的分布,膜骨架,核骨架,胞间连丝等进行了初步的研究。【关键词】细胞骨架,光学显微镜,纤维,网络结构1引言细胞骨架是真核生物细胞中的重要结构,起细胞支架的作用,并参与胞内物质运输、细胞运动、分泌吸收、细胞通讯、有丝分裂等。由于与细胞各项功能的密切关系,细胞骨架的研究已成为当今细胞生物学中较具吸引力的领域之一。对细胞骨架的研究须先对其进行观察。本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料对细胞骨架进行观察研究,基本原理是细胞内脂质和大部分蛋白质可与去垢剂Triton-100形成去垢剂-蛋白/脂质复合物,从而溶于水中被提取,而结合成纤维状的细胞骨架蛋白则保持其在生活细胞中存在的状态。之后用考马斯亮蓝对蛋白质染色,使骨架系统在光学显微镜下可见,从而对其进行观察研究。2材料与方法2.1材料新鲜洋葱鳞茎,撕取内表皮,切成约0.5cm×0.5cm大小。2.2器材光学显微镜、精确天平、0.02ml移液枪、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子。2.3试剂:•M-缓冲液:50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、0.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA、1mmol/LEGTA[乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸]、1mmol/L巯基乙醇。•6mmol/LPH6.8磷酸缓冲液:0.2149gNa2HPO4·12H2O、0.0816gKH2PO4加入100ml蒸馏水。••1%TritonX-100:0.5ml100%TritonX-100加入A液49.5ml。0.2%考马斯亮蓝R250:0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。•3%戊二醛:6ml25%戊二醛加入B液44ml。2.4方法将材料置于装有PH6.8磷酸缓冲液的烧杯中,使其下沉。吸去磷酸缓冲液,用1%TritonX-100处理30分钟。吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗三次,每次10分钟。0.2%考马斯亮蓝R250染色30分钟。用蒸馏水洗1-2次,展平置于载玻片上,加盖玻片,于普通光学显微镜下观察。选取骨架形态清晰、典型的细胞或细胞群,在适当放大倍数下摄像。3结果与分析3.1细胞骨架观察结果光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见(如图1),细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀,细胞核区域的纤维相对密集,蓝色浓重,甚至分辨不出网络结构,另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布;相邻细胞的密集程度基本一致,但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成,纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏,但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓,与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化,表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。3.2细胞骨架的分布制片可观察到较清晰的骨架结构,但是不同切片的细胞骨架在密集度、分布上有差异,可能是处于不同生理状态或处理时间不同所致。对于同一切片,边缘部分的细胞骨架较稀疏,说明Triton-100对细胞骨架蛋白有破坏作用,也反映了细胞骨架蛋白间的结合是可逆的。3.3核骨架多数切片上的细胞可见蓝色较浓重的核区(图1a),但在用Triton处理较久的切片上没有核区轮廓,表明核骨架在形态分布上与细胞质骨架并无明显(至少在光镜下)差异,但由于胞核有核纤层支撑的核膜,较难被去垢剂破坏,使去垢剂难以进入核中起作用,故需处理较长时间才能得到与胞质同样的效果。图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架显微镜照片a:10×10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架(箭头示细胞核区域重染色区)b:10×40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架(上方箭头示膜骨架,下方箭头示胞间连丝处骨架纤维)c:10×100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比(注意两箭头处染色对比)3.4膜骨架对于去垢剂的提取作用,细胞质膜首当其冲,膜脂,膜蛋白...

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