酶的分离纯化VIP免费

酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。正文：1.酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2.酶的分离纯化2.1细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。研磨法：用研钵直接研磨。常用于微生物的微生物材料的破碎。匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。常用于动植物细胞的破碎。2.）物理破碎通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。温度差破碎法应用在脆弱易破的细胞上效果显著。压力差破碎法：通过压力的突然变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法。渗透压法，渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。超声波破碎法：超声波破碎是利用超声波振荡器发射的超声波处理细胞悬浮液。一般认为在超声波作用下液体发生空化作用，液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性漩涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。超声波破碎适用于很多微生物的破碎。3.)化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使得细胞膜的结构改变和破坏，从而破碎细胞。常用有机溶剂，如甲苯、丙酮丁醇、氯仿等；表面活性剂：Triton、Tween。4.）酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶试剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到破碎细胞。常用方法有自溶法和外加酶制剂法。在外加酶法中常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、β-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、β-1,6葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽键内切酶（Endopeptidase）、壳多糖酶等。5.)冻融法生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)等以防破坏目的...