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实用标准文案山东大学实验报告2013年9月19日至10月3日姓名系年级2011级生物技术组别四科目分子实验学号同组者题目pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测一、【实验题目】pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测二、【实验目的】1.掌握碱变性提取法提取质粒的基本原理和方法，理解各种试剂的作用。2.掌握质粒纯化的基本原理及各种试剂的作用。3.掌握琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测分离的原理。4.掌握琼脂糖凝胶电泳的制备和电泳方法。5.掌握琼脂糖凝胶电泳的观察方法及凝胶成像仪的操作方法。三、【实验试剂与器材】1.材料大肠杆菌DH5（E.coliDH5）2.试剂LB液体培养基，氨苄青霉素（Amp）母液（20mg/ml），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3MNaAc溶液，无水乙醇，70%乙醇，TE溶液，RnaseA,苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），灭菌双蒸水ddH2O，1×TAE，6×loadingbuffer，SupercoiledDNALadderMarker，λ-HindIIIdigestDNAMarker，溴化乙锭（EB）3.仪器培养皿，接种环，三角瓶（100ml、300ml），酒精灯，恒温振荡培养箱，50ml离心管，1.5ml塑料离心管（eppendorf管），高速离心机，漩涡振荡器，移液枪，不同型号枪头（10ul，200ul，1ml），电泳仪，微波炉，灭菌锅，吸水纸，记号笔，移液管，洗耳球，PE手套，橡胶手套，滴管，天平，称量纸，冰箱，凝胶成像仪等四、【实验原理】1.碱变性法提取质粒及酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇纯化质粒质粒由于分子小、能自主复制、携带抗性基因、便于分离和提取，经常用在DNA重组中，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，是基因工程中一种非常重要的载体。构建重组DNA分子需要首先从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可以恢复原来的共价闭合环文档大全实用标准文案状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2.琼脂糖凝胶电泳电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位...