1内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文分类号:Q78编号:本科生基因工程实验论文指导教师：王郑学生：阿迪雅专业：生物工程年级：2012级2015年8月16日碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达摘要碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)是一包含2个Zn2+和1个Mg2+的金属酶，纯化后的AP被广泛用于生命和医学科学等领域，如蛋白质标记、分子生物学及酶标记免疫分析等，是基因工程常用的工具酶。该酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，在磷生物地球化学循环过碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达2内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文程中有重要作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作碱性磷酸酶基因，将pET-44a-BAP质粒上的碱性磷酸酶基因用PCR扩增出1369bp的碱性磷酸激酶基因片段，与pMD19-T载体连接后导入感受态的DH5α菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his，导入BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质，用SDS-PAGE鉴定。关键词：碱性磷酸酶，基因表达，载体，大肠杆菌，SDS-PAGE引言...........................................................................41实验材料......................................................................51.1试剂....................................................................51.2仪器....................................................................51.3试验用具................................................................51.4菌种....................................................................51.5质粒....................................................................51.6常用溶液的配制..........................................................62方法.........................................................................72.1引物的设计..............................................................72.2碱性磷酸酶基因的PCR扩增................................................73内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文2.3DH5α和BL21(DE3)感受态的制备...........................................72.4pMD19-T-BAP的构建及转化和检测........................................82.4.1PCR产物(BAP)与pMD19-T（PCR2.1）载体连接....................82.4.2感受态细菌的转化..................................................82.4.3pMD-19-T-BAP的鉴定（提取质粒使用tiangen试剂盒）.................82.5pMD19-T-BAP的酶切和回收................................................92.5.1pMD19-T-BAP双酶切..............................................92.5.2pMD19-T-BAP双酶切胶回收........................................92.6pET-his-BAP的构建及转化和检测.........................................102.6.1pET-his-BAP的构建...............................................102.6.2pET-his-BAP转化BL21.............................................102.7pET-his-BAP的诱导表达.................................................112.8碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测..........................................112.8.1电泳槽的组装及配胶.............................................112.8.2外源基因的诱导表达...............................................123结果与分析..................................................................133.1碱性磷酸酶基因的PCR扩增...............................................133.2pMD19-T-BAP的构建及转化和检测.........................................133.3.1pET-his的质粒电泳检测...........................................143.3.2pET-his酶切结果电泳分析.........................................153.3.3pET-his双酶切胶回收电...
