PCR技术在乙肝方面的应用VIP专享VIP免费

PCR技术在乙肝方面的应用TheapplicationofPCRtechniqueinHBV涿州市医院检验科刘鹏年第一页，共五十五页。HepatitisBVirus乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过。中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%第二页，共五十五页。乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能开展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。第三页，共五十五页。第四页，共五十五页。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科〔hepadnaviridae〕，基因组长度3.2kb目前感染人类最小的DNA病毒局部双链环状DNA。第五页，共五十五页。HBV基因及编码蛋白第六页，共五十五页。HepatitisBVirus第七页，共五十五页。第八页，共五十五页。乙肝的实验室诊断〔一〕生化学检查〔二〕HBV血清学检查〔三〕HBVDNA、基因型和变异检查第九页，共五十五页。生化学检查ALT和AST血清胆红素凝血酶原时间〔PT〕及PTA胆碱酯酶血清白蛋白甲胎蛋白〔AFP〕第十页，共五十五页。生化检测的局限性敏感度有限代表肝细胞损害，水平上下不能代表肝储藏能力关于“胆酶别离〞现象第十一页，共五十五页。HBV血清学检查工程：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)发光免疫分析(定量)第十二页，共五十五页。HBsAg–感染的标志Anti-HBs–既往感染/接种疫苗Anti-HBcIgM–急性感染标志Anti-HBcIgG–既往或慢性感染HBeAg–急性病毒复制，有传染性Anti-HBe–病毒不再复制HBV-DNA–急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反响第十三页，共五十五页。血清学检测的临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义急性或慢性感染(大三阳)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三阳)--++---潜伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢复期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力第十四页，共五十五页。血清学检测的局限性HBV具有“检测窗口期〞假阴性结果无法检测突变株及抗体第十五页，共五十五页。SymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitre第十六页，共五十五页。IgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourse第十七页，共五十五页。第十八页，共五十五页。PCR技术检测HBVDNAPCR聚合酶链式反响于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的创造者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。第十九页，共五十五页。PCR概念PCR〔PolymeraseChainReaction〕即聚合酶链式反响，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。第二十页，共五十五页。PCR反响的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板第二十一页，共五十五页。PCR反响过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性〔denaturation〕:94C30s退火〔annealing〕:55C30s延伸〔extension〕:72C30-60s3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。第二十二页，共五十五页。第二十三页，共五十五页。第二十四页，共五十五页。普通PCR技术的缺点普通PCR技术的缺点普...